攜帶人mda-7/IL-24基因溶瘤腺病毒SG600-IL24構(gòu)建及其選擇性殺傷肝癌細胞的機制研究

肖朝文，鄭小林，蔡常春，鄭建偉，申銘

（1. 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 肝膽胰外科，湖北 武漢 430014；2. 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院 肝膽胰外科，湖北 武漢 430030）

mda-7/IL-24基因最初被命名為黑色素瘤分化相關(guān)基因7（melanoma differentiation associated gene 7，mda-7），又名IL-24，是Fisher教授利用亞減法技術(shù)從黑色素瘤細胞中經(jīng)人干擾素β（IFN-β）和PKC激活劑mezerin（MEZ）誘生而獲得的[1]。研究[2-5]發(fā)現(xiàn)該基因不僅能引起黑色素瘤細胞生長抑制和凋亡，而且能促進其他多種癌細胞的生長抑制和凋亡，但是對正常細胞卻沒有發(fā)現(xiàn)明顯毒性作用，被譽為21世紀(jì)最令人激動的可以攻克腫瘤的基因之一[6]。攜帶人mda-7/IL-24的溶瘤腺病毒，是一種復(fù)制非缺陷型病毒（溶瘤腺病毒），已經(jīng)顯示出了更高的轉(zhuǎn)染效率，因為外源基因能選擇性在腫瘤細胞DNA內(nèi)復(fù)制、增殖、裂解腫瘤細胞，而對正常細胞幾乎沒有影響。課題組前期研究[7-8]已經(jīng)從多個方面證實了攜帶人mda-7/IL-24溶瘤腺病毒SG600-IL24殺傷肝癌細胞株高選擇性，那么其選擇性殺傷肝癌細胞機理到底如何？為了進一步探討這些問題，本課題組運用溶瘤腺病毒SG600-IL24干預(yù)肝癌細胞株HepG2、HCCLM3和正常肝細胞株L02，檢測干預(yù)后肝癌細胞株HepG2、HCCLM3和正常肝細胞株L02內(nèi)不同時間點總STAT3以及信號通路下游信號分子c-myc、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、cyclin D2、survivin、XIAP、OPN、MMP-2、MMP-9和VEGF基因和蛋白的表達變化，同時檢測各細胞株在溶瘤腺病毒SG600-IL24處理后，磷酸化STAT3的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

目的基因、載體和細胞：p Z D 55-I L 24、pClon9、pUC19-INS、SG502-ΔCR2及腺病毒骨架質(zhì)粒ppE3均購于上海新基因公司；HepG2、L02及高轉(zhuǎn)移性人肝癌細胞株HCCLM3購于上海復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所；氨芐青霉素抗性的大腸桿菌DH5a及HEK293細胞株為第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科研究所錢其軍教授惠贈。引物：依據(jù)GeneBank（NM006850）hIL-24的cDNA序列，選其編碼序列（coding sequence，CDS）為目的片段，大小約640 bp，設(shè)計上、下游引物分別為VT371與VT372。序列分別為5'-GAC TCG AGA TGA ATT TTC AAC AGA-3'；5'-ATG GAT CCT CAG AGC TTG TAG AAT-3'，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。試劑：限制性內(nèi)切酶XbaI、BamHI、EcoRI、HindIII、ScaI，高保真pfu酶及快速連接試劑盒（DNA ligation kit）購于New England Biolabs（NEB）公司，質(zhì)粒小樣提取試劑盒、膠回收試劑盒購于QIAGEN公司，肝癌細胞株HepG2、HCCLM3細胞，用高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL），正常肝細胞株L02細胞用1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL)。RT-PCR試劑盒（TAKARA公司），一抗mda-7/IL-24（英國Abcam公司)，兔抗人mda-7/IL-24為英國Abcam公司產(chǎn)品；兔抗人STAT3、p-STAT3、survivin、XIAP、OPN和MMP-2為美國SANTA CRUZ公司產(chǎn)品；鼠抗人c-myc、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、cyclin D2和VEGF為均為美國SANTA CRUZ公司產(chǎn)品；引物的設(shè)計、合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 攜帶目的基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建

酶切質(zhì)粒Z D 55-I L 24得到I L 24連接到pClon9-INS-IL24，將pClon9-INS-IL24共酶切得到INS+IL24片段，裝入SG502-ΔCR2載體中，獲得重組質(zhì)粒pSG600-IL24，并將其送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果與GeneBankNM006850的基因序列完全相符。將293細胞培養(yǎng)于6孔板中（1×106個/孔），當(dāng)細胞匯合率達90%左右時，取純化的穿梭質(zhì)粒SG600-IL24及腺病毒骨架質(zhì)粒ppE3，用Lipofectamine 2000試劑盒共轉(zhuǎn)染293細胞，待9～14 d空斑出現(xiàn)后挑取空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化，提取病毒DNA，應(yīng)用PCR進行鑒定，鑒定正確的腺病毒命名為SG600-IL24，即攜帶人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24，儲存于-80 ℃。

1.3 溶瘤腺病毒的擴增、純化和滴度測定

293細胞在75 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至80%～90%滿時，以10～20病毒顆粒/細胞接種腺病毒，2～3 d后當(dāng)細胞出現(xiàn)CPE反應(yīng)后收集細胞，反復(fù)凍融3次，取病毒上清液再感染293細胞進行大量擴增，2～3 d后收集細胞，PBS重懸，反復(fù)凍融，為了得到滴度更高的病毒，反復(fù)“感染-收集-凍融”3次，最后CsCl離心純化。滴度測定時將HEK293細胞接種于96孔板，然后用50%組織培養(yǎng)感染劑量法（TCID50）來測定病毒滴度。

1.4 病毒感染及實驗分組

溶瘤腺病毒SG600-IL24和SG600-EGFP（攜帶對照基因EGFP）由本實驗室在293細胞內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建，構(gòu)建成功后在293細胞中擴增，CsCl超速離心法純化，病毒滴度由TCID50法測定，溶瘤腺病毒按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=10感染上述細胞。將實驗細胞（HepG2、HCCLM3、正常肝細胞L02）各分為3組：空白對照組（無血清DMEM培養(yǎng)）、SG600-EGFP組（感染對照病毒載體SG600-EGFP）、SG600-IL24組（感染溶瘤腺病毒SG600-IL24）。

1.5 RT-PCR檢測多種基因mRNA的表達變化

取對數(shù)期的肝癌細胞HepG2、HCCLM3和正常肝細胞L02，按上述方法感染，分別于感染24、48、72 h后按TRIzol試劑盒說明提取各組細胞總mRNA，測定RNA的濃度和純度后，進行半定量RT-PCR擴增。目的基因的上、下游引物和擴增片段長度分別如表1所示，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延長10 min。同反應(yīng)條件β-actin擴增片段，長度為20l bp，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶（EB）染色，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照保存，用相關(guān)軟件測量灰度值進行數(shù)據(jù)分析，以目的基因與β-actin的比值表示該目的基因的相對含量，對其進行半定量分析。

1.6 Western bolt檢測多種蛋白的表達變化

取肝癌細胞和正常細胞鋪于6孔板中，按以上方法加入適量病毒，分別于感染24、48、72 h后，按不同時段收集細胞懸浮于裂解液并進行Bradford法蛋白定量。配制8%～15%的SDS-PAGE凝膠電泳板，每孔加50 μg蛋白樣品，100 V電泳2 h，聚偏氟乙烯（PVDF）轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后，再分別加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜，漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，漂洗后加入DAB顯色，凝膠成像測灰度值行數(shù)據(jù)分析。

表1 基因的引物序列Table1 The primer sequences

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件處理。組間比較采用單向方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 溶瘤腺病毒病毒克隆的鑒定

光鏡觀察：可見感染后的HEK293細胞特征性CPE，細胞變大、變圓、漂浮，呈葡萄串聚集。PCR鑒定：取病毒DNA各2 μL為模板，通過PCR方法擴增出約640 bp的特異性片段，其大小與陽性對照相符，而陰性對照則無片段擴增，表明所得的腺病毒即為攜帶人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24（圖1）。

2.2 純化后病毒上清的滴度測定

溶瘤腺病毒S G 600-I L 24可在H E K 293細胞中大量擴增，裂解細胞后收取病毒液，經(jīng)CsCl密度梯度離心，可獲高濃度、高純度的灰白色病毒帶，TCID50測定法測得純化后病毒滴度為2.25×1010PFU/mL，SG600-EGFP滴度為2.79×1010PFU/mL。

圖1 溶瘤腺病毒的PCR鑒定 M：100 bp DNA階梯；1：陽性對照（SG600-IL24質(zhì)粒）；2、3：SG600-IL24病毒；4：陰性對照Figure1 PCR identification of oncolyic adenovirus M:100 bp DNA Ladder; 1:Positive control (SG600-IL24 plasmid); 2, 3:SG600-IL24 adenovirus; 4:Negative control

2.3 RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，肝癌細胞HepG2、HCCLM3和正常肝細胞L02均有mda-7/IL-24基因的表達，而SG600-EGFP組和對照組沒有發(fā)現(xiàn)mda-7/IL-24基因的表達。肝癌細胞HepG2和HCCLM3在感染SG600-IL24后的不同時間點STAT3及其下游的信號通路基因survivin、c-myc、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、cyclin D2、MMP-2、MMP-9和VEGF發(fā)生一系列的變化，除Bax隨時間的延長表達逐步增強外，其余STAT3及其下游的信號通路基因表達均下調(diào)，隨著感染時間的延長，基因表達逐步下降（部分P＜0.05），而正常肝細胞L02無上述的改變（均P＞0.05）（圖2）（表2）。

圖2 SG600-IL24感染后mda-7/IL-24、STAT3及下游信號通路相關(guān)基因的表達Figure2 Gene expressions of mda-7/IL-24, STAT3 and the its downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection

表2 SG600-IL24感染后mda-7/IL-24、STAT3及下游信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達量（±s）Table2 Relative mRNA expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s)

表2 SG600-IL24感染后mda-7/IL-24、STAT3及下游信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達量（±s）Table2 Relative mRNA expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s)

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs. blank control group

細胞 mda-7/IL-24 cyclin D2 c-myc Bcl-2 Bcl-xl Bax HepG2空白對照組 0.01±0.000.22±0.010.92±0.040.60±0.050.22±0.000.02±0.00 EGFP 組 0.01±0.000.30±0.020.88±0.030.58±0.020.20±0.020.22±0.02 SG600-IL24組24 h 0.88±0.001) 0.25±0.020.80±0.030.33±0.021) 0.20±0.020.36±0.031)48 h 0.92±0.041) 0.15±0.011) 0.72±0.0210.28±0.011) 0.18±0.010.45±0.031)72 h 0.94±0.031) 0.05±0.001) 0.10±0.0010.06±0.001) 0.14±0.001) 0.40±0.011 HCCLM3空白對照組 0.02±0.000.22±0.010.82±0.020.44±0.040.32±0.000.03±0.00 EGFP 組 0.02±0.000.18±0.010.80±0.050.38±0.030.34±0.010.04±0.00 SG600-IL24組24 h 0.76±0.011) 0.30±0.020.78±0.040.36±0.040.20±0.000.42±0.031)48 h 0.78±0.021) 0.06±0.001) 0.65±0.030.08±0.011) 0.08±0.011) 0.42±0.011)72 h 0.78±0.021) 0.04±0.001) 0.11±0.001) 0.07±0.001) 0.06±0.001) 0.44±0.021)L02空白對照組 0.00±0.000.24±0.010.22±0.000.22±0.010.32±0.020.02±0.00 EGFP 組 0.00±0.000.33±0.020.26±0.010.23±0.010.28±0.010.03±0.00 SG600-IL24組24 h 0.92±0.041) 0.24±0.020.30±0.020.22±0.010.32±0.020.44±0.021)48 h 0.95±0.031) 0.16±0.001) 0.25±0.010.20±0.020.26±0.010.42±0.011)72 h 0.96±0.031) 0.04±0.001) 0.12±0.000.20±0.000.22±0.000.42±0.021)

表2 SG600-IL24感染后mda-7/IL-24、STAT3及下游信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達量（±s） （續(xù)）Table2 Relative mRNA expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s) (continued)

表2 SG600-IL24感染后mda-7/IL-24、STAT3及下游信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達量（±s） （續(xù)）Table2 Relative mRNA expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s) (continued)

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs. blank control group

細胞 survivin STAT3 MMP-2 MMP-9 VEGF HepG2空白對照組 0.38±0.030.61±0.020.26±0.010.42±0.020.22±0.01 EGFP 組 0.30±0.020.78±0.020.22±0.010.38±0.020.20±0.02 SG600-IL24組24 h 0.28±0.020.86±0.050.03±0.001) 0.10±0.001) 0.22±0.0248 h 0.28±0.010.65±0.020.03±0.001) 0.03±0.001) 0.18±0.0072 h 0.05±0.001) 0.16±0.001) 0.01±0.001) 0.02±0.001) 0.15±0.00 HCCLM3空白對照組 0.43±0.020.43±0.040.22±0.010.43±0.020.29±0.02 EGFP 組 0.41±0.010.38±0.040.20±0.010.46±0.020.30±0.03 SG600-IL24組24 h 0.42±0.020.32±0.030.04±0.001) 0.32±0.010.24±0.0148 h 0.06±0.001) 0.38±0.020.03±0.001) 0.07±0.001) 0.21±0.0072 h 0.04±0.001) 0.16±0.021) 0.02±0.001) 0.06±0.001) 0.05±0.001)L02空白對照組 0.72±0.040.82±0.020.18±0.010.01±0.000.32±0.01 EGFP 組 0.68±0.020.83±0.020.16±0.020.01±0.000.43±0.01 SG600-IL24組24 h 0.68±0.030.85±0.040.02±0.0010.01±0.000.35±0.0048 h 0.62±0.020.82±0.020.02±0.0010.03±0.000.33±0.0272 h 0.60±0.020.80±0.010.01±0.0010.01±0.000.31±0.00

2.4 Western blot檢測結(jié)果

在感染SG600-IL24的3個時間點，肝癌細胞HepG2、HCCLM3和正常肝細胞L02都有mda-7/IL-24蛋白的表達，而SG600-EGFP組和對照組細胞中，未發(fā)現(xiàn)mda-7/IL-24蛋白的表達。HepG2和HCCLM3在分別感染24、48、72 h后STAT3及其下游的信號通路蛋白survivin、c-myc、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、cyclin D2、OPN、XIAP、MMP-2和VEGF發(fā)生一系列的變化，除Bax蛋白隨時間的延長表達逐步增強外，其余STAT3及其下游的信號通路蛋白表達均下調(diào)，隨著感染時間的延長，蛋白表達逐步下降（部分P＜0.05），而正常肝細胞L02無上述改變（均P＞0.05）（圖3）（表3）。

圖3 SG600-IL24感染后mda-7/IL-24、STAT3及下游信號通路相關(guān)蛋白的表達Figure3 Protein expressions of mda-7/IL-24, STAT3 and the its downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection

表3 mda-7/IL-24、STAT3及下游信號通路相關(guān)蛋白相對表達量（±s）Table3 Relative protein expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s)

表3 mda-7/IL-24、STAT3及下游信號通路相關(guān)蛋白相對表達量（±s）Table3 Relative protein expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s)

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs. blank control group

細胞 mda-7/IL-24 cyclin D2 STAT3 c-myc Bcl-2 Bcl-xl Bax HepG2空白對照組 0.01±0.000.89±0.000.52±0.010.96±0.030.54±0.020.56±0.020.01±0.00 EGFP 組 0.03±0.000.85±0.000.45±0.000.88±0.020.61±0.040.66±0.030.01±0.00 SG600-IL24組24 h 0.45±0.011) 0.75±0.000.32±0.001) 0.76±0.000.38±0.001) 0.52±0.010.26±0.011)48 h 0.75±0.021) 0.65±0.000.05±0.001) 0.65±0.000.22±0.001) 0.18±0.001) 0.35±0.011)72 h 0.86±0.031) 0.20±0.0110.06±0.001) 0.10±0.0010.08±0.001) 0.12±0.011) 0.40±0.011)HCCLM3空白對照組 0.02±0.000.42±0.000.42±0.000.95±0.030.82±0.040.80±0.020.03±0.00 EGFP 組 0.03±0.000.33±0.000.33±0.000.85±0.020.73±0.010.75±0.030.01±0.00 SG600-IL24組24 h 0.55±0.011) 0.30±0.000.30±0.000.82±0.010.60±0.000.68±0.000.42±0.01148 h 0.65±0.021) 0.25±0.010.25±0.010.60±0.000.22±0.0010.72±0.020.40±0.02172 h 0.80±0.031) 0.04±0.001) 0.04±0.001) 0.08±0.001) 0.34±0.0010.44±0.0210.66±0.031 L02空白對照組 0.02±0.000.02±0.000.42±0.000.03±0.000.08±0.000.05±0.010.02±0.00 EGFP 組 0.08±0.000.03±0.000.33±0.000.02±0.000.04±0.000.06±0.000.03±0.00 SG600-IL24組24 h 0.75±0.011) 0.02±0.000.30±0.000.02±0.000.05±0.000.28±0.000.05±0.0048 h 0.85±0.041) 0.01±0.000.25±0.010.01±0.000.06±0.010.32±0.000.02±0.0072 h 0.96±0.031) 0.01±0.000.04±0.000.01±0.000.06±0.000.48±0.020.01±0.00

表3 mda-7/IL-24、STAT3及下游信號通路相關(guān)蛋白相對表達量（±s）（續(xù)）Table3 Relative protein expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s) (continued)

表3 mda-7/IL-24、STAT3及下游信號通路相關(guān)蛋白相對表達量（±s）（續(xù)）Table3 Relative protein expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s) (continued)

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs. blank control group

細胞 survivin MMP-2 XIAP OPN VEGF HepG2空白對照組 0.95±0.030.62±0.020.66±0.020.90±0.040.78±0.03 EGFP 組 0.90±0.030.48±0.050.52±0.020.60±0.020.55±0.02 SG600-IL24組24 h 0.82±0.020.40±0.000.42±0.000.24±0.001) 0.45±0.0048 h 0.35±0.001) 0.20±0.001) 0.32±0.021) 0.12±0.001) 0.40±0.021)72 h 0.20±0.011) 0.08±0.011) 0.22±0.001) 0.02±0.001) 0.30±0.001)HCCLM3空白對照組 0.56±0.020.46±0.010.40±0.020.80±0.030.72±0.04 EGFP 組 0.62±0.010.38±0.000.38±0.000.83±0.030.68±0.03 SG600-IL24組24 h 0.32±0.0010.06±0.0010.32±0.000.55±0.021) 0.55±0.0048 h 0.26±0.0010.06±0.0010.20±0.011) 0.88±0.040.48±0.0272 h 0.04±0.0010.04±0.0010.16±0.001) 0.35±0.021) 0.32±0.001)L02空白對照組 0.45±0.010.42±0.020.07±0.000.02±0.000.02±0.00 EGFP 組 0.40±0.000.40±0.010.06±0.000.04±0.000.01±0.00 SG600-IL24組24 h 0.15±0.001) 0.30±0.000.08±0.010.12±0.010.01±0.0048 h 0.06±0.001) 0.25±0.001) 0.06±0.000.11±0.000.03±0.0072 h 0.01±0.001) 0.20±0.001) 0.04±0.000.04±0.000.01±0.00

2.5 STAT3蛋白磷酸化檢測結(jié)果

p-STAT3在SG600-IL24分別感染0、5、30、60、120、240 min后，表達水平先上升后下降，在感染2 h達到峰值，HepG2、HCCLM3蛋白相對表達量分別為1.35±0.12、0.88±0.06，而STAT3在此時間段卻變化不明顯。正常肝細胞STAT3及p-STAT3蛋白變化均不明顯（圖4）。

圖4 SG600-IL24干預(yù)后STAT3及p-STAT3蛋白的表達Figure4 Expressions of STAT 3 and p-STAT3 protein after SG600-IL24 infection

3 討 論

目前肝癌的基因治療方法較多，但多數(shù)方法在殺傷腫瘤細胞的同時也殺傷正常細胞，即不具腫瘤特異性，因而限制了其臨床應(yīng)用。因此，探尋既可選擇性殺傷腫瘤細胞同時又不影響正常細胞的治療性基因已成為腫瘤基因治療的研究熱點。溶瘤病毒和基因治療研究的不斷深入促進了基因病毒療法的發(fā)展，這種療法利用攜帶抗癌基因的溶瘤腺病毒在腫瘤細胞內(nèi)的特異性增殖及復(fù)制的特性，使抗癌基因的拷貝數(shù)大量增加，從而數(shù)百倍乃至上萬倍地提高抗癌基因的表達水平，最終殺滅腫瘤細胞，達到治療的目的[9]。本研究采用端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因啟動子（TERTp）和缺氧基因啟動子HRE來分別調(diào)控病毒復(fù)制必須基因E1A和E1B的表達，同時去除了E1A區(qū)與Rb蛋白結(jié)合的區(qū)域，使病毒只能在腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制，比非溶瘤型的腺病毒Ad.mda-7效果要好，同時具備腫瘤特異性，課題組前期的研究[10]工作做過證實。我們構(gòu)建的SG600-IL24腺病毒正是應(yīng)用以上的策略來達到在腫瘤細胞內(nèi)特異性復(fù)制的目的，對正常細胞影響很小，從而提高其有效性和安全性[11]。

酪氨酸激酶（JAK）家族和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子家族（STAT家族）在不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面發(fā)揮了重要的作用，參與了細胞增值，分化，生存和凋亡等[12]。大量的研究結(jié)果證明STAT家族，尤其是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子STAT3，被認(rèn)為是原癌基因，STAT3在很多人類腫瘤中被異常激活，包括肝癌，淋巴瘤，多種骨髓瘤，前列腺癌，乳腺癌，肺癌，頭頸部腫瘤，卵巢癌，胃癌等，STAT3信號通路已經(jīng)成了研究抗腫瘤基因治療的靶點[13-17]?；虮磉_的變化包括STAT3的持續(xù)激活代表著關(guān)鍵的分子事件，導(dǎo)致了細胞周期調(diào)控和凋亡的失衡，于是促進了腫瘤細胞的增生并大量繁殖，大量異型細胞的形成，最后導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。影響STAT3持續(xù)激活的基因很多，其中包括細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，如cyclin D1[18]和cyclin D2[19]等。STAT3基因的持續(xù)激活也會上調(diào)生存相關(guān)因子，Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1，凋亡抑制家族成員，survivin[20]和XIAP[21]等，另外還有誘導(dǎo)腫瘤血管生成的因子，如VEGF[22-24]等。STAT3在STAT家族7個成員中特別引起人們關(guān)注，因為STAT3被看作是惡性腫瘤治療的有效靶點。在惡性腫瘤細胞中抑制STAT3的持續(xù)激活已經(jīng)顯示出了能抑制腫瘤細胞的生長并誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。另外，細胞周期調(diào)節(jié)蛋白也被認(rèn)為是調(diào)節(jié)STAT3活性的信號轉(zhuǎn)錄子，基于上述的理論基礎(chǔ)，我們觀察溶瘤腺病毒SG600-IL24在STAT3信號傳導(dǎo)方面所發(fā)揮的重要作用，探討其下游的信號通路抗凋亡的機理。

本實驗運用溶瘤腺病毒SG600-IL24干預(yù)肝癌細胞，實驗結(jié)果表明溶瘤腺病毒SG600-IL24能抑制STAT3以及信號通路下游信號分子的基因和蛋白表達水平，SG600-IL24能抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞的凋亡，并且對正常肝細胞沒有明顯的影響。研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)異常的STAT3在促進肝癌細胞生存，促進其異型性方面發(fā)揮了重要的作用，結(jié)果提示STAT3以及信號通路下游信號分子c-myc、Bcl-xl、Bcl-2、cyclin D2、survivin、MMP-2、MMP-9、XIAP、OPN和VEGF基因和蛋白的表達水平均下調(diào)，隨著感染時間的延長，基因和蛋白表達水平逐步下降，而Bax隨時間的延長基因和蛋白表達逐步增強，磷酸化STAT3蛋白在感染后先上升后下降，在感染2 h達到峰值，而正常肝細胞L02卻沒有上述的變化。以前有研究[25]提示mda-7/IL-24選擇性殺傷黑色素瘤細胞是通過IL-20受體依賴途徑介導(dǎo)而不依賴于STAT3信號通路，然而，本研究利用溶瘤腺病毒SG600-IL24干預(yù)治療肝癌細胞卻發(fā)現(xiàn)SG600-IL24抗腫瘤的活性是通過抑制STAT3的活性來促進腫瘤細胞的凋亡，并抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果表明內(nèi)源性的STAT3下降的非常明顯，提示溶瘤腺病毒SG600-IL24很可能通過抑制肝癌細胞STAT3信號通路，最終導(dǎo)致肝癌細胞的凋亡。

綜上所述，本研究揭示了溶瘤腺病毒SG600-IL24選擇性殺傷肝癌細胞的機制，結(jié)果表明異常的STAT3和其在促進肝癌細胞生長和異型性方面發(fā)揮了重要的作用。溶瘤腺病毒SG600-IL24可能通過抑制STAT3及下游的信號通路的基因和蛋白來達到抑癌的作用，而正常肝細胞幾乎不受此影響，使得溶瘤腺病毒SG600-IL24具有顯著的選擇性抗腫瘤效應(yīng)。所以可以預(yù)見，溶瘤腺病毒SG600-IL24將會是一種有效的抗腫瘤治療的手段，未來的病毒基因治療將在臨床上將發(fā)揮越來越關(guān)鍵的作用。