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    魚皮膠原蛋白的提取工藝及特性研究

    2019-03-10 19:34:42于穎肖剛陳晚華
    上海醫(yī)藥 2019年3期
    關(guān)鍵詞:魚皮提取工藝膠原蛋白

    于穎 肖剛 陳晚華

    摘 要 膠原蛋白是生物體內(nèi)重要的組成部分,在生物醫(yī)藥、食品保健、化妝品和組織工程領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。魚皮膠原蛋白因來源廣泛,且具有良好的生物性能,如低抗原性、可降解性以及高生物相容性等優(yōu)勢,已引起研究者的深入研究。本文介紹了魚類膠原蛋白的提取工藝,探討了魚皮膠原蛋白的性質(zhì)及其應(yīng)用前景。

    關(guān)鍵詞 魚皮 膠原蛋白 提取工藝

    中圖分類號:TQ464.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1006-1533(2019)03-0070-04

    Study on the technology for the extraction of fish skin collagen

    YU Ying*, XIAO Gang, CHEN Wanhua**

    (Shanghai Haohai Biotechnology Co., Ltd., Shanghai 201613, China)

    ABSTRACT Collagen is an important component of the organisms and has been widely used in biomedical, food health, cosmetic and tissue engineering fields. Collagen from fish skin has been deeply studied due to its extensive sources and good biological properties, such as low antigenicity, high biocompatibility and biodegradability. In this paper, the technology for the preparation of collagen from fish skin was introduced and its properties and application prospects were discussed.

    KEy WORDS fish skin; collagen; extraction technology

    膠原蛋白是一種白色、不透明、無支鏈的纖維性蛋白質(zhì)類高分子物質(zhì),以不溶性纖維形式存在于動物體的皮膚、骨骼、軟骨、肌腱、韌帶和血管中,對維持血管壁、皮膚彈性和軟骨潤滑度,支撐器官,保護(hù)機(jī)體,提高毛發(fā)亮度等都有重要作用[1]。膠原蛋白作為天然可降解聚合物,具有生物活性高、生物相容性好、降解速度適宜等優(yōu)勢,并且易加工生產(chǎn),是目前理想的生物醫(yī)學(xué)材料之一。在以往,膠原蛋白主要是從牛、豬等陸生哺乳動物的皮膚中獲取[2],由于瘋牛病和口蹄疫等疾病的發(fā)生,使人們對陸生哺乳動物膠原蛋白及其制品的安全性產(chǎn)生質(zhì)疑。再加上有些地區(qū)的習(xí)俗和宗教信仰等原因[3],限制了陸生哺乳動物膠原蛋白制品的生產(chǎn)與銷售。

    從20世紀(jì)70年代人們就開始從魚皮、魚骨、魚鱗等部位提取膠原蛋白,研究發(fā)現(xiàn)魚皮膠原蛋白與陸生哺乳動物膠原蛋白在理化特性、化學(xué)組成和溶液性質(zhì)等存在一定差異[4],這更加激發(fā)了人們的研究熱潮[5]。我國的魚類資源非常豐富,水產(chǎn)業(yè)加工過程中產(chǎn)生了大量的下腳料,比如魚皮、魚頭、魚骨、魚鱗等,而這些廢棄物約占魚體總重的50%~70%,基本上被直接丟棄,如何將水產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生的大量下腳料變廢為寶,充分利用生物資源是科研工作者亟待解決的問題之一,這不僅能產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益,更對保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重大意義。

    1 魚皮膠原蛋白的制備

    1.1 魚皮的預(yù)處理

    魚皮中的脂肪、非膠原和其他雜質(zhì)會影響膠原的純度,降低膠原蛋白的提取率,所以在提取膠原蛋白之前必須進(jìn)行魚皮的預(yù)處理。酸堿處理法和有機(jī)溶劑處理法是目前應(yīng)用最廣泛的前處理方法,一般先將魚皮去除魚鱗,清洗干凈后用一定濃度的NaOH或NaCl浸泡,使魚皮軟化,目的是去除肌原纖維,破壞其膠原成分[6]。

    1.2 魚皮膠原的提取

    迄今為止,魚皮膠原蛋白的提取方法可分為5類:酸法、堿法、酶法、鹽法和熱水浸提法。在實(shí)際提取過程中,為了在保持膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上提高膠原得率,不同的提取方法往往相互結(jié)合。

    1.2.1 酸法提取

    其原理是膠原蛋白分子間的鹽鍵和席夫(Schiff)堿結(jié)構(gòu)在低濃度的酸性條件下不穩(wěn)定,從而進(jìn)行蛋白提取,常采用醋酸、鹽酸、檸檬酸、酒石酸等低酸度溶液。采用酸法提取膠原蛋白需嚴(yán)格控制酸濃度、水解溫度和水解時間,防止膠原蛋白被徹底水解并破壞氨基酸組分[7]。用酸法提取的膠原蛋白得率比較低,常結(jié)合酶法一起提高膠原蛋白的提取率。Muyonga等[8]用乙酸從河鱸幼魚和成魚魚皮中提取酸溶性膠原,得率分別為63.1%和58.7%(以干基計)。Nagai等[9]從虎鯊、鮐魚及歐洲海鱸魚的魚皮中制備酸溶性膠原蛋白,得率分別為40.1%、49.8%和51.4%(以干基計)。Wang等[10]采用響應(yīng)面分析法得到了草魚膠原蛋白的最佳提取條件,即采用0.54 mol/L乙酸于24.7 ℃提取32.1 h,所得的酸溶性膠原蛋白的得率為(19.3±0.5)%。

    1.2.2 堿法提取

    其原理是堿性溶液可以與膠原蛋白相結(jié)合的脂肪發(fā)生皂化反應(yīng),使非螺旋端肽被切除,從而使膠原纖維溶出,常用的堿溶液有石灰石、氫氧化鈉和碳酸鈉。Kolodziejska等[11]采用NaOH處理魷魚皮制得堿溶性膠原蛋白,得率只有3%(以失重計)。Jin等[12]利用采用響應(yīng)面法的中心復(fù)合設(shè)計方法,對金槍魚加工得到的黃鰭金槍魚背鰭皮進(jìn)行膠原蛋白提取的優(yōu)化研究,NaOH濃度在0.92 mol/L,處理24 h后,加入胃蛋白酶至濃度為0.98% (w/v),消化23.5 h,提取得到膠原蛋白得率為27.1%(以失重計)。

    1.2.3 酶法提取

    這是最常用的提取方法,常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等[13-14]。酶法提取膠原蛋白具有反應(yīng)速度快、時間短,提取的膠原蛋白純度高,水溶性好,且沒有改變?nèi)菪Y(jié)構(gòu),只是引起了a1和a2鏈的展開,膠原蛋白的抗原性降低了,這些優(yōu)點(diǎn)更適合作為醫(yī)用生物材料[15]。Nagai等[16]從單眼河豚和墨魚皮中提取的胃蛋白酶促溶性膠原蛋白(PSC)的得率分別為44.7%和35%(以干基計)。Ogawa等[17]從多須石首魚和羊鯛魚皮中提取的PSC分別為15.8%和29.3%(以濕基計)。林琳[18]利用酶工程技術(shù),以魷魚、鱈魚和鯉魚為主要研究對象,通過選擇適宜的蛋白酶和控制酶解過程,研究開發(fā)水產(chǎn)膠原蛋白及其寡聚肽制品,在溫度55 ℃,pH為8.0,酶與底物濃度比為4%的條件下,用堿性蛋白酶properase E水解魚皮膠原蛋白多肽產(chǎn)率最高。以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性為指標(biāo),確定酶解制備膠原蛋白ACE抑制肽的最佳反應(yīng)條件為:酶與底物比為2%、pH為2.0、水解溫度為45 ℃、水解時間5 h。

    1.2.4 鹽法提取

    對于組織中交聯(lián)度低的膠原蛋白可以采用鹽法提取,常用的中性鹽溶液有氯化鈉、氯化鉀、檸檬酸鈉等,該提取方法會影響膠原蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性,一般不適合工業(yè)化應(yīng)用。

    秦玉青等[19]研究了用2%的氯化鈉溶液從魷魚皮中提取了鹽溶性膠原蛋白,其得率為63.8%(以濕基計)。吳文惠等[20]使用磷酸氫二鈉緩沖液(100 mmol/L,pH 7.4~7.6)浸泡馬鮫鯊皮提取膠原蛋白,鯊魚皮膠原蛋白回收率為鮮重的2.9%~4.1%,研究還發(fā)現(xiàn)提取條件的不同會影響膠原蛋白的熱變性溫度和二級結(jié)構(gòu)。

    1.2.5 熱水浸提法

    熱水提取法是原料經(jīng)過前處理后,進(jìn)一步用熱水處理,其溶解性得到了大大提高,一般膠原蛋白的提取率會隨著溫度的升高而提高。由于高溫會導(dǎo)致膠原蛋白的超螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞,因而不具備膠原蛋白的生理功能,該方法提取的膠原蛋白也稱為明膠。Jamilah等[21]用酸、堿預(yù)處理黑、紅羅非魚皮,采用熱水浸提制備膠原蛋白,得率分別為5.39%和7.81%(以濕基計)。趙睿等[22]利用響應(yīng)面優(yōu)化得到鱈魚皮膠原最佳提取條件為pH 5.0,在42 ℃下提取25.7 h,在最優(yōu)條件下膠原蛋白的提取率為83.75%。

    1.3 幾種提取方法的應(yīng)用討論

    膠原蛋白的提取方法根據(jù)不同的原料和提取介質(zhì)而采取不同的方法。水產(chǎn)魚皮、魚鱗膠原蛋白與陸生膠原蛋白相比,更易受溫度、pH、酶等外部環(huán)境的影響,所以熱穩(wěn)定較低,在膠原蛋白提取的過程中需要考慮水產(chǎn)動物的生存條件。比如,六齒金線魚、黑鰭鯊魚、點(diǎn)紋斑竹鯊魚、白鰱的變性溫度在34 ℃;尼羅河鱸魚的變性溫度為36.5 ℃;而六斑二齒鲀的變性溫度只有29 ℃。另外,同一種類水產(chǎn)動物的不同組織部位的變性溫度也有差異,比如章魚觸手的變性溫度為22.5 ℃,外套膜的變性溫度是27.5 ℃。無脊椎動物和硬殼類水產(chǎn)動物很難用酸提取法提取膠原蛋白,通常采用酸法和酶法相結(jié)合,以提高膠原蛋白的得率。利用堿法提取膠原蛋白容易造成肽鍵水解,因此得到的水解產(chǎn)物分子量比較低。如果水解嚴(yán)重,則會產(chǎn)生DL-型氨基酸消旋混合物,其中有些D-型氨基酸有毒,甚至有致畸和致突變作用[13]。若想保留膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu),此法不可取。

    酶法提取比傳統(tǒng)的酸法、堿法提取更溫和、安全和專一。隨著近年來酶制劑的工業(yè)發(fā)展及其提取優(yōu)勢,應(yīng)用越來越廣泛。酶法提取膠原蛋白的試驗(yàn)步驟及條件通常要根據(jù)開發(fā)的產(chǎn)品對分子量的要求而定,要得到分子量較小的膠原多肽常采用多酶水解法,還要考慮酶的種類、加酶量、酶解時間和pH。

    上述方法均存在一定的缺點(diǎn),其中熱水浸提法提取的膠原蛋白大多變性為明膠,需對溫度嚴(yán)格控制;鹽提取方法會影響膠原蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性,生物活性降低;堿法提取會破壞膠原蛋白的氨基酸序列并且產(chǎn)生有毒的物質(zhì);酸法提取的膠原蛋白可保留三股螺旋結(jié)構(gòu),但提取時間長,提取率低;酶法提取雖然得率高,但水解不夠徹底。基于單一提取方法的不足,在實(shí)際的提取過程中常采用酸、酶的結(jié)合使用。

    2 魚皮膠原蛋白的性質(zhì)

    2.1 結(jié)構(gòu)分析

    通常膠原蛋白由三條多肽鏈構(gòu)成的三股螺旋結(jié)構(gòu),每一條左旋形成左手螺旋結(jié)構(gòu),然后以氫鍵相互咬合形成牢固的右手螺旋結(jié)構(gòu)。膠原特有的左旋a鏈相互纏繞構(gòu)成膠原的右手復(fù)合螺旋結(jié)構(gòu),這一區(qū)域稱為“螺旋區(qū)段”,螺旋區(qū)段的最大特征是氨基酸呈現(xiàn) (-Gly-X-Y-)-(-Gly-X-Y-)-周期性排列。 X、Y位置為脯氨酸(Pro)和羥脯氨酸(Hyp),其中甘氨酸(Gly)約占 30%,Pro和Hyp約占25%,Hyp是膠原蛋白特有的氨基酸。

    目前,脊椎動物膠原蛋白的類型有27種[23],魚皮中的膠原類型是Ⅰ型膠原蛋白和Ⅴ型膠原蛋白,其中Ⅰ型膠原是最主要的分子類型,其分子質(zhì)量為30萬道爾頓,直徑1.5 nm,纖維長280 nm,由三條a鏈形成螺旋結(jié)構(gòu)[24]。也有研究發(fā)現(xiàn),膠原蛋白含量越高,魚肉的質(zhì)地越硬,魚肉的嫩化被認(rèn)為與Ⅴ型膠原蛋白降解有關(guān),其肽鏈的破壞引起細(xì)胞外周膠原纖維的裂解,被認(rèn)為是肌肉嫩化的主要原因。

    2.2 熱穩(wěn)定性及溶解性

    魚皮膠原蛋白在低溫下也易溶于中性鹽溶液、稀酸和酸性緩沖溶液中。目前研究發(fā)現(xiàn)魚皮膠原蛋白熱穩(wěn)定性比陸生動物要低,并且魚皮膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與魚類的種特異性相關(guān),這是因?yàn)閬啺被幔≒ro和Hyp)存在差異。Hyp在膠原蛋白中參與跨鏈氫鍵的形成,可以穩(wěn)定膠原的三螺旋結(jié)構(gòu),所以一般從生存在較冷環(huán)境的魚類中獲得的膠原蛋白中Hyp含量較低,熱穩(wěn)定性較差。越來越多的研究證實(shí),魚皮膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與Hyp含量呈正相關(guān)[25]。

    3 魚皮膠原蛋白及其酶解產(chǎn)物的研究熱點(diǎn)

    膠原是一種優(yōu)良的可降解的生物材料,在醫(yī)學(xué)上廣泛用于傷口敷料、人工皮膚、組織工程海綿體、可降解縫合線等[26]。魚皮膠原蛋白及其酶解產(chǎn)物膠原活性肽已引起人們的深入研究,膠原多肽是膠原經(jīng)蛋白酶降解后的產(chǎn)物,主要有血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶抑制肽、抗氧化活性肽、抗腫瘤活性肽和免疫調(diào)節(jié)肽等。研究發(fā)現(xiàn),膠原活性肽具有多方面的生理功能[27],如保護(hù)胃黏膜以及抗?jié)冏饔?、抑制血壓上升、促進(jìn)皮膚膠原代謝及Ca2+吸收和降低血清中膽固醇含量等。海洋生物來源的蛋白質(zhì)無論是氨基酸組成還是氨基酸序列均與陸地生物來源的蛋白有較大差異,同時,由于生物漫長的進(jìn)化過程,海洋生物蛋白資源的種類和數(shù)量均遠(yuǎn)超陸地生物蛋白資源,這是人類的天然寶庫,故具有生物功能的低分子活性肽的開發(fā)更是研究的熱點(diǎn)。目前已有陸生動物源和植物源的活性多肽產(chǎn)品上市,如谷胱甘肽、酪蛋白肽、乳清肽、血清肽、大米肽、玉米肽等。另外,魚皮膠原蛋白熱穩(wěn)定性較差,如何提高魚皮膠原蛋白的熱穩(wěn)定,也將是值得關(guān)注的問題。隨著魚皮膠原蛋白在生物醫(yī)學(xué)材料方面和化妝品領(lǐng)域中的研究開發(fā),不同魚種來源的膠原蛋白與人體的生物相容性、皮膚吸收滲透性、免疫原性等方面有待更加深入的研究[28]。

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