氫對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜衰老的保護(hù)機(jī)制

李睿嬋，劉 華，李麗華

?KEYWORDS:hydrogen; oxidative stress injury; DNA damage

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)又稱為老年性黃斑變性，是老年人的首要致盲疾病[1]。由于ARMD會(huì)導(dǎo)致患者中心視力喪失，其致盲率高，因此患者的生活質(zhì)量極度下降。隨著全球人口老齡化日益突出，ARMD的患病率也不斷上升。為此，探討該疾病病理機(jī)制以及尋找新的治療方法迫在眉睫。而導(dǎo)致ARMD的病因較多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且爭(zhēng)議較多，盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)ARMD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)和臨床研究，但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前尚缺乏理想的治療方法和藥物。研究表明，碘酸鈉(sodium iodate，NaIO3)鼠尾靜脈注射可使視網(wǎng)膜發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞重要的蛋白和DNA受到破壞[2]，是目前模擬ARMD較為理想的動(dòng)物模型。氧化應(yīng)激是造成ARMD的主要原因之一[3]，又有研究表明視網(wǎng)膜衰老也是ARMD發(fā)病的重要因素[4]，并且氧化應(yīng)激通過損傷DNA使維持細(xì)胞基本生理功能的基因表達(dá)失活，從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老[5]。我們之前的研究初步證實(shí)，氫(hydrogen，H2)通過減少Sirt3蛋白表達(dá)的下調(diào)并抑制衰老對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷起保護(hù)作用[6]。由于在衰老發(fā)生過程中，伴隨活性氧(reactive oxygen species, ROS)誘導(dǎo)的氧化線粒體DNA損傷產(chǎn)生[7]，并且還有相關(guān)研究表明DNA損傷常常伴有氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過研究氫對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷保護(hù)作用的機(jī)制，探討通過降低DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)以延緩視網(wǎng)膜衰老對(duì)視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組取6～8周齡C57BL/6J正常雄性小鼠30只，體質(zhì)量18～24g(購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)，21℃ 12h光照，12h黑暗。動(dòng)物管理符合動(dòng)物保護(hù)條例并符合動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。實(shí)驗(yàn)前通過裂隙燈檢查排除眼前節(jié)疾病，按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、模型組(NaIO3處理組)和治療組(H2水灌胃組)，每組10只。

1.1.2試劑和儀器酶標(biāo)儀、凝膠電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；恒溫水浴鍋(上海榮計(jì)達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器公司)；ECL發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。NaIO3粉末(北京索萊寶公司)，戊巴比妥鈉粉末(美國(guó)Sigma公司)；H2水(北京活力氫源飲品有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；兔抗小鼠ATM單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)、兔抗小鼠NF-κB單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)、兔抗小鼠細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)、兔抗小鼠HMGB1單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，以及小鼠抗小鼠GAPDH單克隆抗體(Proteintech公司)。HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(Proteintech公司)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(Proteintech公司)；ECL顯影液(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1建立視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷模型用9g/L生理鹽水溶解NaIO3粉末，濃度為2mg/mL，4℃保存。模型組小鼠生理鹽水灌胃7d后造模，按20mg/kg劑量鼠尾靜脈注射NaIO3，再行生理鹽水灌胃5d；對(duì)照組小鼠注射相同劑量的9g/L生理鹽水12d。治療組NaIO3注射前小鼠予富含H2的飲用水灌胃(6mL/d)預(yù)防性治療7d，然后與模型組一同鼠尾靜脈注射NaIO3，注射后繼續(xù)灌胃治療5d。

1.2.2HE染色每組隨機(jī)取3只小鼠，石蠟切片，常規(guī)HE染色，具體步驟同本課題組之前的研究[6]。

1.2.3SA-β-gal染色檢測(cè)氫對(duì)小鼠視網(wǎng)膜衰老的影響衰老的細(xì)胞會(huì)表達(dá)一種特異性的衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶。這種酶特異性存在于衰老的細(xì)胞中，檢測(cè)衰老相關(guān)的SA-β-gal的活性變化即成為檢測(cè)衰老的重要指標(biāo)[9]。每組隨機(jī)取3只小鼠的右眼，40g/L多聚甲醛固定過夜，300g/L蔗糖脫水，OCT包埋后切片，切片厚8μm，將其固定在載玻片上，在5mL/L戊二醛/PBS(pH=6.0)中室溫固定15min，固定后將視網(wǎng)膜在PBS(pH=6.0)中洗滌2次，在SA-β-gal染色溶液中浸泡37℃孵育過夜，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4Western-blot檢測(cè)簡(jiǎn)言之，每組剩余的4只小鼠，分別摘取小鼠雙眼視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜組織蛋白提取物(15～20μg)通過二烷基苯磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，1% BSA封閉2h，一抗與TBS按照1∶1000的比例稀釋，4℃搖床孵育過夜。TBST洗3次，每次6min，二抗與TBS按照1∶2000的比例稀釋，室溫下?lián)u床孵育2h。ECL顯色，暗室曝光，通過凝膠成像系統(tǒng)記錄圖像。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，Image J 4.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)半定量分析。

2結(jié)果

2.1氫對(duì)NaIO3誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷的影響HE染色結(jié)果見圖1，NaIO3可引起視網(wǎng)膜變薄。它不僅降低了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)與感光細(xì)胞之間的黏附力，而且還使RPE層不連續(xù)。并且在RPE周圍出現(xiàn)點(diǎn)狀和大小不均勻的大量黑色沉積物。此外，光感受器內(nèi)節(jié)段(inner segment，IS)和外節(jié)段(outer segment，OS)幾乎無(wú)法識(shí)別。外核層(outer nuclear layer，ONL)中的細(xì)胞數(shù)量下降，該層的線性結(jié)構(gòu)消失并且有半玫瑰花結(jié)構(gòu)和內(nèi)陷的形成，在用H2治療的小鼠中防止了這種損失。同樣，NaIO3小鼠內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)中的細(xì)胞密度降低。我們發(fā)現(xiàn)H2不僅可以減少布魯赫膜中NaIO3誘導(dǎo)的黑色沉積物的數(shù)量和大小，還可以減少視網(wǎng)膜變薄。此外，H2防止了ONL和INL細(xì)胞密度的降低和無(wú)序排列。

2.2氫對(duì)小鼠視網(wǎng)膜衰老的影響SA-β-gal染色結(jié)果見圖2，在光學(xué)顯微鏡下觀察，衰老形態(tài)的細(xì)胞SA-β-gal染色呈藍(lán)綠色。對(duì)照組著染陰性，僅有個(gè)別著染藍(lán)綠色的細(xì)胞；模型組SA-β-gal著染藍(lán)綠色的細(xì)胞較對(duì)照組顯著增加，表明伴隨NaIO3誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的增加，視網(wǎng)膜細(xì)胞的衰老也增多；而治療組SA-β-gal著染藍(lán)綠色的細(xì)胞與模型組相比顯著減少。由此推斷，H2可以抑制視網(wǎng)膜衰老，對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞起保護(hù)作用。

2.3氫對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜中DNA損傷反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3)，模型組中DNA損傷反應(yīng)相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量(ATM 0.77±0.08，NF-κB 0.70±0.02，Cyclin D1 0.36±0.01)較對(duì)照組(ATM 0.17±0.012，NF-κB 0.27±0.02，Cyclin D1 0.07±0.002)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，說明氧化應(yīng)激的產(chǎn)生誘導(dǎo)了DNA損傷。而治療組中DNA損傷反應(yīng)相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量(ATM 0.10±0.009，NF-κB 0.32±0.01，Cyclin D1 0.19±0.002)較模型組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=708.7、142.6、105.3，均P<0.01)，表明H2能夠降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜DNA損傷。

圖1小鼠視網(wǎng)膜HE染色A：對(duì)照組；B：模型組；C：治療組(圖中黃色箭頭指示為黑色玻璃膜疣沉積物)。

圖2小鼠視網(wǎng)膜SA-β-gal染色A：對(duì)照組；B：模型組；C：治療組。

圖3氫對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜中DNA損傷反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響A：DNA損傷反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)水平；B：各組ATM、NF-κB、Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較。aP<0.05，bP<0.01vs治療組。

圖4氫對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜中DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響A：DNA修復(fù)蛋白HMGB1表達(dá)水平；B：各組HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較。bP<0.01vs模型組。

2.4氫對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜中DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4)，三組HMGB1蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=82.66，P<0.01)。且模型組中HMGB1蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.383±0.07)較對(duì)照組(1.232±0.03)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而治療組中HMGB1蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.927±0.06)較模型組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明氫可以促進(jìn)視網(wǎng)膜DNA損傷修復(fù)。

3討論

ARMD是黃斑區(qū)的退行性病變，可使中心視力進(jìn)行性、不可逆性喪失，嚴(yán)重威脅著老年人的視力，是發(fā)達(dá)國(guó)家中老年人視力不可逆下降的主要原因[10]。近年來(lái)，我國(guó)社會(huì)人口老齡化不斷加劇，ARMD 的發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)[11]。隨著我國(guó)人民生活水平的提高，人均壽命的延長(zhǎng)，人們對(duì)生活質(zhì)量越來(lái)越重視，影響人視覺健康的眼病日益受到全社會(huì)的關(guān)注。盡管黃斑變性是多因素導(dǎo)致的眼底部疾病，但據(jù)報(bào)道，年齡是ARMD最主要的危險(xiǎn)因素，高齡ARMD患者的死亡率增加[12]。視網(wǎng)膜衰老是ARMD發(fā)病的重要因素，因此，如能減緩視網(wǎng)膜的衰老就可以從源頭上減少ARMD發(fā)病率，并減慢其病程進(jìn)展[13]。而細(xì)胞的氧化損傷在衰老過程中起著重要作用[14]。氧化應(yīng)激是衰老的促進(jìn)因素[15]。在衰老和衰老相關(guān)疾病中可以發(fā)現(xiàn)過多的ROS及其他氧化應(yīng)激產(chǎn)物[5]，因此降低ROS水平已成為鑒定是否有效抗衰老的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)[16]。由于目前沒有藥物可以完全模擬臨床ARMD疾病，NaIO3是一種穩(wěn)定的氧化劑，誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷目前被認(rèn)為是ARMD研究的理想動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)延用我們之前的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[6]，通過HE染色發(fā)現(xiàn)NaIO3造模后，可使視網(wǎng)膜變薄，降低了RPE層與感光細(xì)胞之間的黏附力并且使RPE層不連續(xù)；在布魯赫膜中出現(xiàn)點(diǎn)狀和大小不均勻的大量黑色沉積物。此外， INL層和ONL層細(xì)胞數(shù)量下降，線性結(jié)構(gòu)消失。且我們之前的研究已經(jīng)表明，氫能夠減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜衰老相關(guān)蛋白P53、P21和P16蛋白表達(dá)[6]。本研究中利用衰老特異性SA-β-gal染色，可見給予H2后顯著減少了視網(wǎng)膜中藍(lán)綠色沉淀，這進(jìn)一步驗(yàn)證了我們之前的研究。

由于高能量需求及光暴露，視網(wǎng)膜對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感[3]，過量的ROS可以損害視網(wǎng)膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，隨后導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡[2]。衰老可以由DNA損傷有關(guān)的各種刺激引發(fā)[17]，并且DDR的激活證明發(fā)生了細(xì)胞衰老[18]。DNA損傷會(huì)激活A(yù)TM[19]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療組ATM的表達(dá)量明顯低于模型組。還有研究表明，Cyclin D1過表達(dá)增強(qiáng)了DDR，相反Cyclin D1減少則降低了DDR，并且Cyclin D1蛋白表達(dá)升高會(huì)伴隨P21蛋白的上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)了DDR[20]，所以我們進(jìn)一步檢測(cè)了Cyclin D1的表達(dá)，結(jié)果顯示治療組中Cyclin D1表達(dá)量較模型組明顯降低。此外，DDR下游的參與者中有NF-κB，其可以被DNA損傷激活，反過來(lái)NF-κB活化又會(huì)導(dǎo)致DNA損傷增加[21]，數(shù)據(jù)顯示ATM也可以激活NF-κB[22-23]，故我們還檢測(cè)了NF-κB的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)治療組中NF-κB表達(dá)量較模型組明顯降低。最后，有報(bào)道稱高遷移率族蛋白HMGB1有DNA修復(fù)功能[24]，可以挽救DNA損傷，延長(zhǎng)壽命[25]，所以本研究進(jìn)一步探討其是否也有這種作用，結(jié)果顯示治療組中HMGB1表達(dá)量較模型組顯著上調(diào)。綜上說明氫通過降低DDR、促進(jìn)DNA的修復(fù)，進(jìn)而對(duì)視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷起保護(hù)作用。保護(hù)線粒體DNA免受氧化應(yīng)激損傷將是延緩ARMD進(jìn)展的一種新策略[26]。

我們的研究為治療ARMD提供了新思路，但對(duì)ARMD病理機(jī)制和治療還需繼續(xù)深入開展，進(jìn)一步探索ARMD發(fā)病機(jī)制，并開發(fā)ARMD治療藥物仍是研究工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。