張 峰,趙 龍,樊金萍吳雪伶孟淑芳*
(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 100050;2.包頭市腫瘤醫(yī)院,內(nèi)蒙古 包頭 014030)
腫瘤細(xì)胞基因組DNA及其片段可在體外試驗(yàn)中轉(zhuǎn)化NIH 3T3細(xì)胞,使其獲得體內(nèi)致瘤能力,腫瘤細(xì)胞基因組DNA中具有轉(zhuǎn)化能力的基因被稱(chēng)為癌基因。HRAS屬于RAS基因家族(包括HRAS、KRAS和NRAS),通過(guò)與GTP/GDP結(jié)合,RAS蛋白作為分子開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)與細(xì)胞存活和增殖相關(guān)的RAF-MEK-ERK、PI3K/AKT等信號(hào)傳導(dǎo)通路,HRAS突變與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。體內(nèi)外試驗(yàn)中,雖然Q61L突變的HRAS(T24-HRAS)可在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中誘發(fā)尿路上皮癌[2],但正常HRAS基因需要其他癌基因(如SV40的大T抗原或cMYC基因)的輔助才能轉(zhuǎn)化細(xì)胞[3]。2008年,Li等使用分別表達(dá)T24-HRAS和cMYC的混合質(zhì)粒首次在NIH小鼠中誘發(fā)皮膚腫瘤,劑量為每只12.5μg時(shí),腫瘤發(fā)生率分別為20%(成年小鼠)和82%(乳鼠)。使用同時(shí)表達(dá)T24-HRAS和cMYC的單一質(zhì)粒,腫瘤發(fā)生率提高至40%(成年小鼠)和100%(乳鼠)。進(jìn)一步研究中,使用NK細(xì)胞和T細(xì)胞缺陷的CD3ε小鼠替代NIH小鼠,成年小鼠中的致瘤率提高至75%,最低致瘤劑量降低至每只800 pg[4-6]。但截至目前尚沒(méi)有使用單一的HRAS表達(dá)質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中誘發(fā)腫瘤的報(bào)道。本研究嘗試使用含有G12C、G13C、Q61R和G12C/G13C/Q61R突變的HRAS(V112A)表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)皮內(nèi)注射在NIH小鼠體內(nèi)誘發(fā)腫瘤。
人結(jié)腸癌DiFi細(xì)胞和L929小鼠成纖維瘤細(xì)胞由中國(guó)食品藥品檢定研究院細(xì)胞室提供;SPF級(jí)NIH小鼠由中國(guó)食品藥品檢定研究院試驗(yàn)動(dòng)物繁育中心提供;HRAS基因由DiFi細(xì)胞中擴(kuò)增,經(jīng)測(cè)序,其含有V112A突變,將其命名為HRAS(V112A);pCDNA3.1(+)質(zhì)粒由本室保存;鼠抗人HRAS抗體和鼠抗GAPDH抗體購(gòu)自中杉金橋公司;引物(表1)由上海生物工程技術(shù)有限公司合成;Trizol、Lipofectamine 2000和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Superscript First-Strand Synthesis System)購(gòu)自Invitrogen公司;pMD-18-T載體、2×Primer Start Premix購(gòu)自Takara公司;質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自Gibco公司。
表1 研究中使用的引物
Trizol提取DiFi細(xì)胞總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板,以HRAS-NheⅠ-F+HRAS-R1引物和HRAS-F1+HRAS-Hin dⅢ-R引物分別擴(kuò)增HRAS(V112A)的1~440 nt片段和44~570 nt片段,切膠回收PCR產(chǎn)物并混合作為模板,以HRAS-NheⅠ-F和HRAS-Hin d Ⅲ-R 引物擴(kuò)增全長(zhǎng) HRAS(V112A)(570 bp)。NheⅠ和Hin d Ⅲ雙酶切PCR產(chǎn)物及pCDNA3.1(+)質(zhì)粒,4℃過(guò)夜連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取重組質(zhì)粒測(cè)序,獲得pC-HRAS(V112A)重組質(zhì)粒。
按照文獻(xiàn)方法[7],采用定點(diǎn)突變PCR方法,對(duì)HRAS(V112A)的12、13和61位密碼子分別進(jìn)行G12C、G13C和Q61R點(diǎn)突變及3個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合突變。簡(jiǎn)要描述如下:①配制50μL突變體系,含1μL pC-HRAS(V112A)、2 pmol混合突變引物(針對(duì)突變位點(diǎn)的正/反向突變引物,如:RM-G12C-F和RM-G12C-R各1 pmol混合)、25 μL 2×Primer Start Premix。②突變PCR。95℃變性5 min;95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃擴(kuò)增12 min,25個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。③模板質(zhì)粒降解,PCR產(chǎn)物中加入1μL Dpn I酶37℃消化過(guò)夜。④突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,挑克隆測(cè)序,根據(jù)測(cè)序結(jié)果選取在目的位置含有設(shè)計(jì)突變的克隆,根據(jù)突變類(lèi)型,將質(zhì)粒分別命名為 pC-HRAS(V112A/G12C)、 pC-HRAS(V112A/G13C)、pC-HRAS(V112A/Q61R)和 pC-HRAS(V112A/G12C/G13C/Q61R)。
按照說(shuō)明書(shū)操作,各質(zhì)粒使用Lipofectamine 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染6孔板中的L929細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48 h刮取細(xì)胞并使用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2遍后重懸于0.25 mL PBS中。細(xì)胞懸液中加入1/5體積6×SDS加樣緩沖液煮沸5 min,13 000 r/min離心10 min,取上清10%SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜,以抗GAPDH抗體檢測(cè)GAPDH為內(nèi)對(duì)照,抗人HRAS抗體檢測(cè)HRAS(V112A)的表達(dá);腫瘤組織中HRAS蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)中,按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行樣品處理[8],用剪刀取1 g病變組織剪碎至乳糜狀,置于1 mL PBS中煮沸5 min,13 000 r/min離心10 min,取上清用于Western blot檢測(cè)。
按質(zhì)粒大提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,提取含HRAS(V112A)及點(diǎn)突變的質(zhì)粒,溶解于生理鹽水,紫外分光光度法測(cè)定濃度,根據(jù)檢測(cè)結(jié)果質(zhì)粒濃度調(diào)整至2 mg/mL。取6~8周齡雌性NIH小鼠,每組8只,分別于左側(cè)腋下按每只100μg(50μL)皮內(nèi)注射pC-HRAS(V112A)[HRAS(V112A)組]、pC-HRAS(V112A/G12C)[HRAS(V112A/G12C)組]、pC-HRAS(V112A/G13C)[HRAS(V112A/G13C)組]、pC-HRAS(V112A/Q61R)[HRAS(V112A/Q61R)組]、 pC-HRAS(V112A/G12C/G13C/Q61R)[HRAS(V112A/G12C/G13C/Q61R)組]和生理鹽水(對(duì)照組)。注射后于正常條件下飼養(yǎng),定期觀察注射部位及全身病變情況。
病變組織中DNA的分離采用文獻(xiàn)中的煮沸法[9-10],簡(jiǎn)要描述如下,質(zhì)粒注射后4個(gè)月,取1 g病變組織剪刀剪碎至乳糜狀,置1 mL PBS中煮沸5 min,13 000 r/min離心10 min,取1μL上清作為模板,使用HRAS-NheⅠ-F和HRAS-R1引物擴(kuò)增HRAS 1~440 nt片段,切膠回收后連接pMD-18T載體測(cè)序。
以DiFi細(xì)胞cDNA為模板,PCR擴(kuò)增HRAS,將擴(kuò)增產(chǎn)物插入真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)并測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與人 HRAS 基因(Access Number:AB451336)比對(duì),擴(kuò)增的HRAS在335 nt位發(fā)生G-C突變,導(dǎo)致其112位的Val突變?yōu)锳la(V112A)。為排除聚合酶錯(cuò)配導(dǎo)致的突變,再次擴(kuò)增,該突變?nèi)匀淮嬖?,將含有V112A 突 變 的 HRAS 基 因 命 名 為 HRAS(V112A)。以HRAS(V112A)為模板,使用Site-directed PCR突變[7]方法對(duì)設(shè)計(jì)位點(diǎn)進(jìn)行突變,測(cè)序結(jié)果表明各HRAS(V112A)突變體均在設(shè)計(jì)位置含有預(yù)期突變,Blast及測(cè)序比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖1。
以pCDNA3.1(+)空質(zhì)粒作為對(duì)照,含HRAS(V112A)及其突變體的重組pCDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后收取細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2A。本研究Western blot檢測(cè)使用抗HRAS抗體購(gòu)自中杉金橋公司,為OriGene產(chǎn)品,雖然抗體所用的免疫原為全長(zhǎng)重組人HRAS蛋白,但該抗體與小鼠HRAS蛋白有交叉反應(yīng),因此對(duì)照細(xì)胞(泳道1)21 kD位置有較弱的陽(yáng)性顯色條帶,但顯色強(qiáng)度顯著弱于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。pC-HRAS(V112A)、pC-HRAS(V112A/G12C)、pC-HRAS(V112A/G13C)、pC-HRAS(V112A/Q61R)和 HRAS(V112A/G12C/G13C/Q61R)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中,21 kD位置均有HRAS強(qiáng)顯色條帶。Western blot檢測(cè)中HRAS均顯示為2~3條帶,且G12C突變HRAS的電泳遷移速率慢于野生型,而Q61R突變HRAS的遷移速率快于野生型,該現(xiàn)象與文獻(xiàn)[11-12]的報(bào)道結(jié)果相同,證明本研究中的重組質(zhì)粒能夠在細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)HRAS(V112A)及其各突變體。目前尚未見(jiàn)報(bào)道Gly13突變HRAS的電泳遷移速率變化情況,本研究中,G13C突變同G12C突變的HRAS(V112A)的遷移速率相近,均慢于HRAS(V112A)。HRAS(V112A/G12C/G13C/Q61R)的遷移速率慢于 HRAS(V112A/Q61R),但快于 HRAS(V112A)、HRAS(V112A/G12C)和HRAS(V112A/G13C)。
圖1 HRAS(V112A)的Blast結(jié)果及各突變體測(cè)序結(jié)果
各質(zhì)粒于腋下位置皮內(nèi)注射N(xiāo)IH小鼠后3個(gè)月,HRAS(V112A)組 和 HRAS(V112A/Q61R)組 分 別 有 4 只(50%)和1只(12.5%)小鼠于注射部位出現(xiàn)病變,小鼠噬咬導(dǎo)致脫毛和皮損(圖 3A),HRAS(V112A/G12C)組、HRAS(V112A/G13C)組和 HRAS(V112A/G12C/G13C/Q61R)組小鼠均未出現(xiàn)明顯病變。HRAS(V112A)組中,4只小鼠注射部位皮膚變厚呈增生樣改變,皮膚表面出現(xiàn)麥粒大小疣狀物,取1只小鼠處死后剪取病變皮膚測(cè)量,增生物體積約0.8 cm×0.4 cm×0.3 cm,外有包膜包裹,無(wú)明顯新生血管穿透包膜(圖3B)。剩余3只出現(xiàn)增生樣改變的小鼠在注射后5個(gè)月,病變自行消退。HRAS(V112A/Q61R)組中,1只小鼠在注射后4個(gè)月于注射部位生成腫瘤,體積約4.8 cm×2.2 cm×1.8 cm(圖3C),解剖后可見(jiàn)腫瘤外有包膜包裹,新生血管穿過(guò)包膜進(jìn)入腫瘤內(nèi)部(圖3D),腫瘤中心部位呈糜樣壞死,壞死部分約占腫瘤體積1/3。制備切片后進(jìn)行病理學(xué)檢查可見(jiàn),核漿比增大,細(xì)胞核大小形態(tài)及染色深淺不一(圖4),表現(xiàn)為惡性腫瘤樣病理改變。小鼠體內(nèi)致瘤試驗(yàn)證明,每只小鼠單獨(dú)皮內(nèi)注射100μg的pC-HRAS(V112A/Q61R)質(zhì)??稍贜IH小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)形成腫瘤。
圖2 Western blot檢測(cè)HRAS(V112A)及突變體在L929細(xì)胞中的表達(dá)
采用PCR和Western blot方法檢測(cè)HRAS(V112A)組和HRAS(V112A/Q61R)組小鼠病變組織中HRAS核酸序列和蛋白表達(dá)情況。PCR可在病變組織中擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶,回收擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體測(cè)序,HRAS(V112A)組和HRAS(V112A/Q61R)組分別挑取10個(gè)和3個(gè)重組克隆送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明,擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列均與各組注射的HRAS基因序列對(duì)應(yīng)(比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖5)。通過(guò)比對(duì)可以發(fā)現(xiàn),HRAS(V112A)組增生樣組織和HRAS(V112A/Q61R)組腫瘤組織中擴(kuò)增的HRAS序列均含有V112A突變,10個(gè)HRAS(V112A)組HRAS擴(kuò)增序列中均不含G12C、G13C和Q61R突變,而3個(gè)HRAS(V112A/Q61R)組HRAS擴(kuò)增序列中僅含有Q61R突變。值得注意的是,40%的HRAS(V112A)組HRAS序列和33%的HRAS(V112A/Q61R)組HRAS序列中含有除設(shè)計(jì)位點(diǎn)以外的其他突變,該現(xiàn)象在腫瘤組織已有報(bào)道,可能為腫瘤組織中細(xì)胞微環(huán)境紊亂和異常增生導(dǎo)致的基因突變所致[13-14]。
Western blot檢測(cè)病變組織中HRAS的表達(dá),分別取HRAS(V112A/Q61R)組小鼠腫瘤的實(shí)體、壞死組織、HRAS(V112A)組小鼠增生樣病變組織進(jìn)行Western blot檢測(cè),上述組織泳道中21 kD位置均有明顯HRAS顯色條帶,而對(duì)照組小鼠皮膚泳道中HRAS條帶顯色強(qiáng)度顯著弱于上述組織(圖6)。Western blot檢測(cè)的結(jié)果可 見(jiàn) , HRAS(V112A/Q61R)仍 然 顯 示 出 較 HRAS(V112A)更快的遷移速率,說(shuō)明腫瘤組織中的HRAS基因在61位氨基酸位置存在突變。結(jié)合PCR和Western blot結(jié)果,可以認(rèn)定HRAS(V112A/Q61R)組中腫瘤發(fā)生與注射pC-HRAS(V112A/Q61R)質(zhì)粒相關(guān)。
圖3 HRAS(V112A)組及HRAS(V112A/Q61R)組小鼠病變
圖4 pC-HRAS(V112A/Q61R)誘發(fā)腫瘤的病理學(xué)檢查結(jié)果
圖5 小鼠腫瘤中擴(kuò)增HRAS的測(cè)序結(jié)果
RAS基因(包括KRAS、NRAS和HRAS)的突變與腫瘤有密切的關(guān)系,在約15%的人類(lèi)腫瘤中,可檢測(cè)到RAS基因的突變,特別是在胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌中,突變RAS的檢出率分別可達(dá)90%、50%和30%。常見(jiàn)的RAS基因突變位點(diǎn)為12和13位密碼子,占比約80%和17%,61位密碼子突變占比不足4%,在每個(gè)突變位點(diǎn)又存在多種突變形式[2]。本研究中,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選取G12C、G13C、Q61R以及3個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合突變的HRAS(V112A)作研究對(duì)象,分析不同突變體能否在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤[15]。本研究中,從人結(jié)腸癌細(xì)胞系DiFi中擴(kuò)增HRAS含有V112A突變,該突變?cè)谥暗奈墨I(xiàn)報(bào)道中從未出現(xiàn),但也有文獻(xiàn)報(bào)道除常見(jiàn)的12、13、61位氨基酸突變外,HRAS可含有其他與癌癥相關(guān)的罕見(jiàn)突變類(lèi)型,如 12(G)11 等[16]。Crowder等[17]在人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系OPM-2中檢測(cè)到K117V突變,該突變位點(diǎn)位于HRAS蛋白的GTP結(jié)合位點(diǎn)附近,展現(xiàn)出比G12V突變更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化活性。與之前使用單獨(dú)的T24-HRAS不能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)腫瘤的結(jié)果不同,本研究中,單獨(dú)HRAS(V112A/Q61R)的表達(dá)即可在NIH小鼠中誘發(fā)腫瘤的發(fā)生,該結(jié)果可能部分歸因于V112A突變賦予HRAS更強(qiáng)的致瘤活性。
HRAS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能由兩個(gè)蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié):鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)化因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs)促進(jìn)HRAS與GDP的解離并與GTP結(jié)合,啟動(dòng)HRAS介導(dǎo)的激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);而GTP酶激活蛋白(GTPase-activating proteins,GAPs)則可激活 HRAS 的GTP酶活性,將GTP降解為GDP,關(guān)閉信號(hào)傳導(dǎo)。若HRAS突變后使其GTP酶活性降低,則可延長(zhǎng)激活信號(hào)的持續(xù)時(shí)間,增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力,從而誘發(fā)腫瘤。HRAS蛋白的GTP酶活性依賴(lài)于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域:位于1~86 AA的SwitchⅡ結(jié)構(gòu)域和位于87~171 AA的Helix 3結(jié)構(gòu)域[18](圖7)。GAP的精氨酸手指可借助電荷作用伸入HRAS的內(nèi)部與SwitchⅡ結(jié)合,提供正電荷穩(wěn)定GTP水解過(guò)程中產(chǎn)生的負(fù)電荷,增強(qiáng)HRAS的GTP酶活性[19]。若HRAS第12位氨基酸由比移值(Rate of flow,Rf)為0.30/0.06的疏水性較弱的Gly突變?yōu)槭杷暂^強(qiáng)的氨基酸,如:Ile(Rf=0.79/0.57)、Val(Rf=0.67/0.32)和 Leu(Rf=0.77/0.52),可影響 HRAS 與 GAP 的結(jié)合,降低HRAS的GTP酶活性,延長(zhǎng)激活信號(hào)的作用時(shí)間,促進(jìn)細(xì)胞增殖;如果突變?yōu)槭杷暂^弱的Pro(Rf=0.48/0.16)或極性氨基酸,則不會(huì)影響/增強(qiáng)HRAS與GAP結(jié)合,不影響/增強(qiáng)HRAS的GTP酶活性[20-23],縮短激活信號(hào)的作用時(shí)間,抑制細(xì)胞增殖。當(dāng)前關(guān)于G13突變的文獻(xiàn)報(bào)道較少,但結(jié)構(gòu)研究表明G13也位于HRAS的GTP酶活性結(jié)構(gòu)域,因此可以推測(cè)G13突變對(duì)HRAS GTP酶活性的影響與G12相同[24]。根據(jù)上述分析,本研究中采用的G12C和G13C突變均為使用極性更強(qiáng)的非水解的極性氨基酸Cys(Rf=0.08/0.02)替代弱極性的Gly,增強(qiáng)HRAS與GAP的結(jié)合,從而會(huì)增強(qiáng)HRAS的GTP酶活性,因此G12C和G13C突變可能反而降低了HRAS(V112A)的致瘤活性。根據(jù)上述討論,也就可以理解在HRAS(V112A)組出現(xiàn)增生樣病變的情況下,HRAS(V112A/G12C)、HRAS(V112A/G13C)和含有上述兩個(gè)突變的HRAS(V112A/G12C/G13C/Q61R)組小鼠中均未出現(xiàn)明顯病變。HRAS蛋白通過(guò)61位Gln的氨基基團(tuán)形成氫鍵與GAP的精氨酸指結(jié)構(gòu)作用[25-26],使用Arg替代Gln后,產(chǎn)生靜電斥力,降低HRAS與GAP的相互作用,降低HRAS的GTP酶活性,因此HRAS(V112A/Q61R)展現(xiàn)出更強(qiáng)的致瘤能力。
圖6 Western blot檢測(cè)HRAS(V112A)及突變體在NIH小鼠病變組織中的表達(dá)
圖7 HRAS蛋白3D結(jié)構(gòu)示意圖[18]
之前文獻(xiàn)報(bào)道中,使用分別表達(dá)T24-HRAS和cMYC的質(zhì)?;旌虾笞⑸涞姆绞?,每只小鼠注射劑量為12.5μg時(shí),成年和新生小鼠中的致瘤率分別為20%和82%,但單獨(dú)使用的T24-HRAS表達(dá)質(zhì)粒未能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤形成[4-5]。本研究中,當(dāng)每只注射劑量為100 μg時(shí),pC-HRAS(V112A/Q61R)在成年NIH小鼠中的的致瘤率為12.5%,該致瘤率雖然低于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道,但首次在單獨(dú)使用HRAS表達(dá)質(zhì)粒的條件下,在NIH小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤形成。