凌 敏,楊明晶,梁 婕,陳東亞,張 薇,卞 倩*
(江蘇省疾病預防控制中心毒理與風險評估研究所,江蘇 南京 210009)
納米二氧化鈦(nano-TiO2)因具有較好的光催化活性、抗紫外線、強表面吸附能力和特殊的光電效應等特性,已被廣泛應用于涂料、纖維、塑料、油漆、精細陶瓷、化妝品和食品等領域[1-4]。常規(guī)尺度的TiO2被認為基本無毒,其已獲得美國食品藥品管理局(FDA)批準為食品添加劑使用[5]。而由于nano-TiO2粒徑小,因此理化性質會表現出不同于常規(guī)粒子的特性,進入機體后能引起不一樣的生物學效應[6]?,F在國內外研究越來越關注nano-TiO2的安全性及潛在毒性。研究發(fā)現nano-TiO2對免疫系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心臟和肝腎等器官及對哺乳動物生殖發(fā)育均產生一定的影響[4-5,7]。因此,對nano-TiO2生物安全性的評估和研究具有重要現實意義。本研究通過擴展一代繁殖試驗(OECD 443)觀察nano-TiO2暴露對F1子代大鼠免疫功能的影響,為nano-TiO2的安全性評價提供基礎毒理學數據參考。
13周齡SPF級SD大鼠90只,雄性30只,雌性60只,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物生產許可證號:SCXK(京)2016-0011號。實驗在江蘇省疾病預防控制中心毒理與風險評估研究所動物實驗室進行。屏障環(huán)境實驗動物使用許可證號:SYXK(蘇)2017-0031號。實驗室溫度20~24 °C,濕度40%~70%。實驗期間動物自由飲水、攝食。粒徑為5~30 nm的nano-TiO2購自美國Nanostuctured and Amorphous Materials公司,由國家食品安全風險評估中心提供。用滅菌水配置成25 mg/mL的nano-TiO2混懸液,實驗前用超聲處理器進行超聲分散。
Accuri C6流式細胞儀(美國BD),Scientz-II D超聲波細胞破碎機(寧波新生物科技股份有限公司),ADVIA?2120血細胞分析儀(德國Siemen),細胞篩、紅細胞裂解液、CD3/CD4/CD8大鼠流式檢測抗體、CD3/CD45RA/CD161a大鼠流式檢測抗體(美國BD),1640培養(yǎng)基(美國Gibco),綿羊血紅細胞(南京森貝伽生物科技有限公司)。
雌、雄大鼠適應3 d后分性別按隨機方法分入各組,對照組和nano-TiO2組均為45只,其中雄性大鼠15只,雌性大鼠30只。nano-TiO2組每天按10 mL/kg灌胃給予25 mg/mL的nano-TiO2混懸液1次,對照組每天灌胃給予等體積生理鹽水。灌胃2周后,同組大鼠按雌∶雄為2∶1比例于晚上合籠,次日早晨進行陰栓及陰道涂片檢查。每組保證至少20只孕鼠。各組雌鼠在交配期、妊娠期和哺乳期繼續(xù)灌胃染毒,直至子鼠離乳。雌鼠在子鼠離乳后處死。子鼠從離乳到出生后56 d(PND56)持續(xù)每天灌胃1次染毒。PND56子鼠處死后稱體質量,收集肝、脾臟和胸腺,計算臟器系數[臟器系數=臟器質量(g)/動物體質量(g)×100%],并進行脾和潘氏淋巴結分型和抗體生成細胞檢測。
每組隨機選取10只子鼠,雌雄各半。頸椎脫臼處死后,迅速取脾和小腸潘式淋巴結后將其放入盛有5 mL 1640培養(yǎng)基的平皿中,用注射器針頭劃碎,然后經細胞篩過濾,300 g離心5 min,棄上清。加入2 mL紅細胞裂解液裂解5~10 min后,300 g離心5 min,用無菌PBS洗3遍,懸浮于1~2 mL 1640完全培養(yǎng)基中。經CD3/CD4/CD8和CD3/CD45RA/CD161a大鼠流式抗體染色后上流式細胞儀進行淋巴細胞分型檢測,得出T細胞、B細胞、NK細胞比例及計算CD4/CD8陽性細胞比值。
用生理鹽水將無菌脫纖維綿羊血細胞濃度調整為5×109個/mL,每組隨機選取10只子鼠,雌雄各半,腹腔注射綿羊血紅細胞(SRBC)0.4 mL致敏。免疫5 d后,將子鼠頸椎脫臼處死,取出脾臟,制成單細胞懸液,進行溶血空斑試驗。計數溶血空斑數,用每百萬個脾細胞內含空斑形成細胞的平均數來表示抗體生成細胞數。
實驗結果數據用xˉ±s表示,采用SPSS 13.0軟件進行t檢驗,以α=0.05為檢驗水準。
由表1可見,與對照組比較,nano-TiO2組雌鼠脾臟系數升高,而雄鼠肝臟系數降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。其余觀察指標與對照組間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
表1 Nano-TiO2對F1代子鼠免疫器官臟器系數的影響(x±s,%,n=20)
見表2和表3。與對照組相比,nano-TiO2組脾和潘式結淋巴細胞分型結果差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
表2 Nano-TiO2對F1代子鼠脾淋巴細胞分型和脾抗體生成細胞數的影響±s,n=10)
表2 Nano-TiO2對F1代子鼠脾淋巴細胞分型和脾抗體生成細胞數的影響±s,n=10)
性別雌性雄性組 別對照組nano-TiO2對照組nano-TiO2 CD4/CD8陽性細胞比值1.67±0.38 1.69±0.33 1.78±0.32 1.76±0.28 B細胞比例/%50.27±4.28 47.88±3.18 47.83±5.21 49.06±4.36 T細胞比例/%31.25±3.22 32.31±2.59 31.32±3.38 27.84±3.84 NK細胞比例/%10.34±2.43 11.51±1.13 10.55±1.79 10.72±0.91空斑數203.0±94.6 292.7±164.2 224.9±95.0 249.8±82.7
表3 Nano-TiO2對F1代子鼠潘式結淋巴細胞分型的影響s,n=10)
表3 Nano-TiO2對F1代子鼠潘式結淋巴細胞分型的影響s,n=10)
性別雌性雄性組 別對照nano-TiO2對照nano-TiO2 CD4/CD8陽性細胞比值4.18±0.53 3.59±1.37 3.59±1.12 3.45±0.61 B細胞比例/%47.61±7.61 54.27±8.54 35.32±6.76 33.09±9.64 T細胞比例/%27.56±3.54 26.18±4.37 26.82±6.82 25.18±6.01 NK細胞比例/%2.08±0.55 2.05±0.49 2.03±0.58 2.19±0.55
由表2可見,抗體生成細胞檢測試驗結果顯示nano-TiO2組子代大鼠溶血空斑數與對照組相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
隨著納米技術的發(fā)展,納米材料廣泛應用于食品、制藥、電子產品、化妝品、添加劑等領域[8-9]。納米顆粒(1~100 nm)由于其在納米尺度下,會呈現出不同于其分子形式的物理化學性質[10]。納米顆粒進入生命體后產生一系列的生物學效應與常規(guī)尺度的物質不同,它可通過與生物體的蛋白、核酸分子及細胞相互作用,而產生生物毒性,如呼吸毒性、生殖毒性、神經毒性等[11-13]。近年來,隨著人們接觸納米材料的機會越來越多,因此其對人體健康及環(huán)境帶來的潛在危害也引起了廣泛的關注。
免疫系統(tǒng)對于機體防御病原體的入侵和維持機體自身的穩(wěn)定狀態(tài)具有非常重要的作用及意義,往往動物在早期或小劑量接觸毒物時,機體其他系統(tǒng)還未受到損害,免疫系統(tǒng)就會先受到影響[14]。機體免疫由特異性免疫和非特異性免疫組成。特異性免疫應答包括細胞免疫與體液免疫,T細胞主要介導機體的細胞免疫,B細胞是體液免疫的主要細胞[15-16]。而T細胞又分為CD4+和CD8+T淋巴細胞,正常情況下,這兩種細胞保持在一種平衡狀態(tài)下,CD4/CD8陽性細胞的比值可直接反映機體免疫狀況,是維持機體健康的重要指標[17-18]。
Fu等[19]采用氣管滴注nano-TiO2對SD大鼠進行染毒,染毒組劑量分別為0.5、4和32 mg/kg,每周2次,連續(xù)28 d,結果發(fā)現,nano-TiO2對大鼠免疫細胞及器官有一定影響,隨著染毒劑量的增加,B淋巴細胞數量增加,但是T細胞亞群數量和NK細胞數量與對照組相比無顯著差異;病理學顯示,高劑量組肺泡腔內和淋巴結可見納米棕色顆粒和團塊物質沉積,脾和胸腺未見異常。Wang等[20]用5 g/kg的nano-TiO2對小鼠進行1次灌胃染毒,14 d后觀察發(fā)現nano-TiO2可在脾臟蓄積,但并未發(fā)現脾臟的病理學改變。Park等[21]用20 mg/kg nano-TiO2對小鼠進行經口灌胃染毒,脾淋巴細胞分型結果發(fā)現,與對照組相比NK細胞、B細胞增加,而T細胞減少,CD4/CD8陽性細胞比值下降。Sang等[22]發(fā)現將不同濃度(2.5、5 和 10 mg/kg)nano-TiO2對小鼠持續(xù)灌胃90 d,小鼠外周血內CD3+、CD4+、CD8+和B細胞和NK細胞量,以及CD4/CD8陽性細胞比率較對照組降低。這些研究表明不同濃度和作用不同時間的nano-TiO2暴露會攻擊實驗動物的免疫系統(tǒng),使其受到不同程度的損傷。
由于納米粒子容易自發(fā)凝聚,表現出強烈的團聚性,而失去納米粒子所具有的特性。在本實驗室條件下,我們通過超聲分散的方法使nano-TiO2在滅菌水中保持納米特性且穩(wěn)定性在一周內保持良好,25 mg/mL為能達到的最高配制濃度。本研究用25 mg/mL的nano-TiO2混懸液對親代大鼠及子鼠進行灌胃染毒(灌胃體積為10 mL/kg),結果發(fā)現nano-TiO2組F1子代雌鼠脾臟及雄鼠肝臟相對質量與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但由于病理學檢查未發(fā)現異常,且不存在性別一致性,相對質量數據的變化在本實驗室歷史數據及文獻報道范圍內,因此認為差別無生理學意義。但機體免疫功能的改變通常發(fā)生在器質性改變之前,因此,我們進一步檢測了子代大鼠脾和潘氏結淋巴細胞分型。與對照組相比,Nano-TiO2組脾與潘式結淋巴細胞分型結果差異均無統(tǒng)計學意義,提示nano-TiO2對子代大鼠B細胞和T細胞亞群的穩(wěn)定性無明顯影響。
溶血空斑試驗是一種體外檢測抗體形成細胞的方法,是國際上一致認可檢測體液免疫較為敏感且有效的指標,通過計數抗體形成細胞的數量可以反映對小鼠B細胞活化的能力和抗體生成的能力,從而評價對機體體液免疫的影響[17,23]。本研究結果顯示與對照組相比,nano-TiO2組F1子代雌雄大鼠溶血空斑數均無顯著變化(P>0.05)。提示在 250 mg/kg 劑量下 nano-TiO2對子代大鼠體液免疫功能無明顯影響。
綜上,本研究通過一代繁殖毒性擴展試驗探討nano-TiO2對子代大鼠免疫功能的影響,旨在為nano-TiO2生物安全性的評估提供有益參考,為日后制定相關nano-TiO2使用規(guī)范的國家標準和納米材料毒性評估提供理論依據。根據本研究結果發(fā)現,nano-TiO2在250 mg/kg劑量下,未發(fā)現對F1子代大鼠免疫功能產生異常影響。