小桐子CDPK及相關(guān)激酶基因家族的 全基因組鑒定及表達(dá)分析

王海波,郭俊云,辛 胡,劉 潮,高 永,代冬琴,唐利洲

(1.曲靖師范學(xué)院 云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心，云南省高校云貴高原動(dòng)植物遺傳多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物資源與食品工程學(xué)院，云南曲靖 655011；2.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，昆明 650224)

在植物的整個(gè)生命周期中，受到外界多種生物與非生物環(huán)境因素的影響，在長(zhǎng)期的進(jìn)化中，植物形成了一套復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)系統(tǒng)，經(jīng)過胞外信號(hào)感知、膜上信號(hào)轉(zhuǎn)換、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，及基因表達(dá)與蛋白活性可逆調(diào)控，以適應(yīng)多變的外界環(huán)境[1]。Ca2+作為第二信使，在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用，在植物體中多種信號(hào)途徑都會(huì)促發(fā)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，進(jìn)而通過鈣信號(hào)感應(yīng)器(CDPK-SnRK超家族)將信號(hào)傳遞至下游級(jí)聯(lián)系統(tǒng)，包括：鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase，CDPK/CPK)、鈣依賴蛋白激酶相關(guān)激酶(CDPK-related protein kinase，CRK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase kinase，PPCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶相關(guān)激酶(PEP carboxylase kinase-related kinase，PEPRK)及鈣與鈣調(diào)素依賴蛋白激酶(Calcium and calmodulin-dependent protein kinase，CCaMK)等[2-4]。CDPK是植物與部分原生生物(Protozoa)特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為典型的Ca2+傳感器，可不需要鈣調(diào)素(Calmodulin，CaM)而被Ca2+直接激活[5]。典型的植物CDPK蛋白屬于單體蛋白，僅由1條多肽鏈組成，從N端到C端包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域(功能區(qū))，即N端可變區(qū)[包含豆蔻酰化(Myristoylation)與棕櫚?；?Palmitoylation)位點(diǎn)]、具有催化活性的Ser/Thr蛋白激酶區(qū)、活性控制的自抑制連接區(qū)以及包含2～4個(gè)EF-hand基序負(fù)責(zé)結(jié)合Ca2+的CaM調(diào)控區(qū)[6-7]。催化區(qū)由約300個(gè)氨基酸殘基組成，具有典型的Ser/Thr蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，且不同物種中同源性較高。自抑制連接區(qū)由20～30個(gè)氨基酸殘基組成，在沒有Ca2+存在時(shí)，負(fù)責(zé)結(jié)合催化區(qū)的激酶結(jié)構(gòu)域從而抑制其活性。調(diào)控區(qū)通過2～4個(gè)結(jié)合Ca2+的EF hands基序控制自抑制區(qū)的抑制活性[8]。CDPK調(diào)控區(qū)通過結(jié)合Ca2+解除自抑區(qū)對(duì)激酶區(qū)的抑制作用從而激活CDPK的活性，特別的獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其同時(shí)具有Ca2+感應(yīng)器與效應(yīng)器的功能，在Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮核心作用。另外，CRK未鑒定到自抑區(qū)以及調(diào)控區(qū)的EF-hand基序，而CCaMK的自抑區(qū)與鈣及鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域重疊，且調(diào)控區(qū)僅包含3個(gè)EF-hand基序，PPCK與PEPRK都包含激酶結(jié)構(gòu)域，而PEPRK在N端與C端還包含可變區(qū)，但兩者都沒有結(jié)合Ca2+的EF-hand基序[7-9]。

研究表明，CDPK在植物的大部分器官中都有分布，且參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的大部分過程，如細(xì)胞骨架建成、氣孔運(yùn)動(dòng)、小分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、碳氮代謝以及生物與非生物脅迫響應(yīng)等。目前，已經(jīng)對(duì)許多植物從全基因組水平進(jìn)行CDPK及相關(guān)基因家族鑒定，CDPK基因家族包括擬南芥34個(gè)[8]、水稻31個(gè)[9]、玉米40個(gè)[10]、楊樹30個(gè)[11]，CRK基因家族包括擬南芥8個(gè)[12]、水稻5個(gè)[9]、楊樹9個(gè)[11]、番茄6個(gè)[13]；另外，在擬南芥中分別鑒定到PPCK、PEPRK、CCaMK基因2、2、0個(gè)[8]，對(duì)應(yīng)水稻中包括0、2、1個(gè)[9]。小桐子(JatrophacurcasL.)屬大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬(Jatropha)落葉灌木或小喬木，作為世界公認(rèn)的具有巨大開發(fā)潛力的能源樹種，其種子含油量高、品質(zhì)好，是加工生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料，具有廣闊的開發(fā)利用前景。日本Kazusa DNA研究所在2011年公布小桐子基因組測(cè)序數(shù)據(jù)[14]，為從基因組水平上分析小桐子CDPK及相關(guān)激酶基因家族提供條件。本研究對(duì)小桐子CDPK及相關(guān)激酶基因家族從全基因組水平進(jìn)行鑒定，并對(duì)其序列特征、進(jìn)化關(guān)系及表達(dá)特性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究CDPK及相關(guān)激酶家族基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小桐子CDPK及相關(guān)激酶基因家族的鑒定

根據(jù)Cheng等[12]鑒定的模式植物擬南芥的CDPK及相關(guān)激酶基因家族登錄號(hào)，從擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥34個(gè)CDPK基因、8個(gè)CRK基因、2個(gè)PPCK基因、2個(gè)PEPRK基因以及水稻的1個(gè)CCaMK基因[9]蛋白質(zhì)序列，通過ClustalX進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用Hmmer 3.0軟件的Hmmbuild程序?qū)⒈葘?duì)文件生成CDPK結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫HMM模型，同時(shí)，從GenBank下載小桐子最新注釋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫?；谝陨夏Ｐ停肏mmer 3.0軟件的Hmmsearch程序?qū)π⊥┳拥鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索(參數(shù)設(shè)置：閾值E<1e-10，序列相似性>50%)，得到候選的小桐子CDPK及相關(guān)激酶蛋白質(zhì)序列，利用Excel腳本去除重復(fù)序列。將非冗余的候選序列利用Pfam與CDD在線工具進(jìn)行CDPK激酶結(jié)構(gòu)域分析，得到最終的小桐子CDPK及相關(guān)激酶家族蛋白質(zhì)序列。

1.2 小桐子CDPK及相關(guān)激酶家族基因及蛋白質(zhì)的特征分析

根據(jù)鑒定的小桐子CDPK及相關(guān)激酶蛋白質(zhì)登錄號(hào)，從GenBank下載其對(duì)應(yīng)的基因序列、mRNA序列以及CDS(Coding sequence，CDS)序列。利用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)CDPK及相關(guān)激酶蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸數(shù)目、理論分子質(zhì)量(Mw)、等電點(diǎn)(pI)等基本參數(shù)的分析。亞細(xì)胞定位采用CELLO服務(wù)器V2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行鑒定。利用PROSITE(http://prosite.expasy.org/)在線分析工具對(duì)CDPK及相關(guān)激酶蛋白質(zhì)序列進(jìn)行motif分析。利用ClustalX(Version 2.0)進(jìn)行序列相似性比對(duì)，然后用MEGA 6.0軟件通過鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并采用自展法(Bootstrap)進(jìn)行檢驗(yàn)。利用GenDOC軟件對(duì)ClustalX比對(duì)結(jié)果進(jìn)行CDPK及相關(guān)激酶蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析。通過CDS序列與基因序列比對(duì)以確定基因內(nèi)含子與外顯子的結(jié)構(gòu)，并利用GSDS(Gene Structure Display Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)圖。另外，染色體定位以Wu等[15]構(gòu)建的小桐子遺傳連鎖圖譜進(jìn)行錨定，并通過MapChart(Version 2.1)繪制基因定位圖。

1.3 小桐子CDPK及相關(guān)激酶家族基因的表達(dá)分析

從GenBank的SRA數(shù)據(jù)庫下載小桐子不同器官的Illumina高通量測(cè)序數(shù)據(jù)(葉片SRR1639660、根SRR1639659、種子SRR1639661)。通過Bowtie2與Samtools工具將鑒定到的小桐子CDPK及相關(guān)激酶家族基因與測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到各CDPK及相關(guān)激酶基因的表達(dá)reads數(shù)據(jù)，之后通過Cufflinks程序計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)量FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)值，進(jìn)行以2為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化，并設(shè)置以基因與器官同時(shí)進(jìn)行聚類，聚類方法選擇層次聚類法(Hierarchical Clustering)。另外，將鑒定的小桐子CDPK及相關(guān)激酶家族基因序列對(duì)低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[16]進(jìn)行比對(duì)，通過編號(hào)得到各基因在對(duì)照與12 ℃低溫處理12、24及48 h的低溫?cái)?shù)字基因表達(dá)譜(Digital Gene Expression，DGE)[17]中的原始表達(dá)標(biāo)簽CleanTaq數(shù)據(jù)，進(jìn)一步通過TPM(Transcript per Million Clean Tags)獲得標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)量[18-19]，經(jīng)過log2(處理TPM/對(duì)照TPM)轉(zhuǎn)化，得到小桐子CDPK及相關(guān)激酶家族基因在低溫處理下的差異表達(dá)數(shù)據(jù)。利用R軟件(Version 3.4.1)的gplots與pheatmap函數(shù)進(jìn)行聚類分析及熱圖(heatmap)的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 小桐子CDPK及相關(guān)激酶基因家族的鑒定與序列特征

在小桐子全基因組共鑒定到17個(gè)CDPK基因，分別命名為JcCDPK1-JcCDPK17，5個(gè)CRK基因(JcCRK1-JcCRK5)、2個(gè)PPCK基因(JcPPCK1、JcPPCK2)、4個(gè)PEPRK基因(JcPEPRK1.1、JcPEPRK1.2、JcPEPRK2.1、JcPEPRK2.2)及1個(gè)CCaMK基因(JcCCaMK)(表1)。理化參數(shù)分析結(jié)果表明，小桐子JcPPCK1與JcPPCK2基因(1 389 bp、1 574 bp)與蛋白(271 aa、276 aa)序列較短，CDPK及相關(guān)激酶基因長(zhǎng)度分布在2 904(JcCDPK15)～9 631(JcCDPK14)bp，蛋白序列長(zhǎng)度分布在466(JcPEPRK2.1)～630(JcCRK5)aa。其中，等電點(diǎn)有明顯的家族特異性，CDPK基因家族的Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ亞族、PPCK基因家族Ⅰ亞族、CCaMK基因家族成員的等電點(diǎn)都偏酸性與中性，分布在5.31(JcCDPK10)～7.21(JcCDPK11)，而CDPK基因家族的Ⅳ亞族、CRK基因家族及PPCK基因家族Ⅱ亞族都偏堿性，分布在8.43(JcPEPRK2.2)～9.02(JcCDPK17)。CELLO亞細(xì)胞定位顯示，小桐子CDPK基因家族主要定位細(xì)胞質(zhì)(15個(gè))、其次為細(xì)胞核(2個(gè)，JcCDPK2與JcCDPK17)，CRK基因家族定位細(xì)胞核與葉綠體，PPCK基因家族都定位細(xì)胞質(zhì)，PEPRK基因家族定位細(xì)胞核與細(xì)胞膜，而CCaMK定位細(xì)胞核。

2.2 小桐子CDPK及相關(guān)激酶基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化與基因結(jié)構(gòu)

根據(jù)Harbak等[8]關(guān)于擬南芥CDPK及相關(guān)激酶基因家族的分類標(biāo)準(zhǔn)，通過MEGA構(gòu)建小桐子與擬南芥CDPK及相關(guān)激酶基因家族進(jìn)化樹(圖1、圖2)，可見小桐子與擬南芥聚類結(jié)果(圖1)與小桐子單獨(dú)聚類結(jié)果(圖2)完全吻合，小桐子CDPK基因家族也聚類為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個(gè)亞族，基因數(shù)量分別為6、5、6、1，較擬南芥對(duì)應(yīng)亞族基因10、13、8、3數(shù)量少，其中第Ⅳ亞族只有JcCDPK17基因。另外，小桐子CRK、PPCK及PEPRK基因家族分別鑒定到5、2、4個(gè)基因，對(duì)應(yīng)擬南芥中包含8、2、2個(gè)基因，CCaMK基因家族在擬南芥中未發(fā)現(xiàn)，而在小桐子中鑒定到1個(gè)對(duì)應(yīng)JcCCaMK基因，與Asano等[9]在水稻中鑒定到OsCCaMK1(GenBank登錄號(hào)：AC097175)的報(bào)道一致。

結(jié)合小桐子29個(gè)CDPK及相關(guān)激酶家族的聚類結(jié)果，基因結(jié)構(gòu)分析顯示，小桐子CDPK基因家族除Ⅳ亞族JcCDPK17包含12個(gè)外顯子外，其他3個(gè)亞族都包含6～9個(gè)外顯子(圖2、表1)，且首尾外顯子都與5-UTR與3-UTR區(qū)域重合，中間為分散且長(zhǎng)度較短的外顯子。其中，Ⅰ亞族除JcCDPK4(9個(gè)外顯子)，都包含7個(gè)外顯子，且都鑒定到5-UTR與3-UTR區(qū)域；Ⅱ亞族除JcCDPK15(6個(gè)外顯子)，都包含8～9個(gè)外顯子，而JcCDPK2與JcCDPK15分別缺失5-UTR與3-UTR區(qū)域；Ⅲ亞族包含7～9個(gè)外顯子，而JcCDPK16缺失5-UTR區(qū)域。同時(shí)，小桐子CRK基因家族成員都包含11個(gè)外顯子，且外顯子分布規(guī)律完全一致，PPCK基因家族成員都包含2個(gè)外顯子，PEPRK基因家族包含3～5個(gè)外顯子，且Ⅰ(JcPEPRK1.1、JcPEPRK1.2)與Ⅱ(JcPEPRK2.1、JcPEPRK2.2)亞族成員基因結(jié)構(gòu)一致，而CCaMK基因家族的唯一成員JcCCaMK包含7個(gè)外顯子。

黑色圓點(diǎn)表示Bootstrap檢驗(yàn)值的大小 Bootstrap values were represented by black dots

圖2 小桐子CDPK及相關(guān)激酶基因家族的基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structure of J.curcas CDPK and its related kinase genes family

2.3 小桐子CDPK及相關(guān)激酶氨基酸序列分析

為了分析小桐子CDPK及相關(guān)激酶的保守序列，通過多序列比對(duì)鑒定到小桐子CDPK家族成員的N-端可變區(qū)、激酶結(jié)構(gòu)區(qū)、自抑區(qū)及EF-hand調(diào)控區(qū)4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域以及其他激酶成員的激酶結(jié)構(gòu)域。其中，N-端可變區(qū)氨基酸序列整體變化較大，而前8個(gè)氨基酸殘基相對(duì)保守，PROSITE分析顯示該區(qū)域是與CDPK及相關(guān)激酶修飾調(diào)控相關(guān)的序列，通過ExPASY的N-Myristoylation與CSS-plam 4.0工具分析29個(gè)小桐子CDPK及相關(guān)激酶表明，有21個(gè)鑒定到與N-豆蔻酰化(N-Myristoylation)修飾相關(guān)的核心氨基酸殘基Cys，其中11個(gè)可能會(huì)發(fā)生N-豆蔻酰化修飾，另外，有24個(gè)可能會(huì)發(fā)生N-十六烷?；?N-Palmitoylation)修飾(表1)。

CDPK及相關(guān)激酶都包含約300aa的核心激酶結(jié)構(gòu)域，多序列比對(duì)結(jié)果表明，小桐子CDPK的激酶結(jié)構(gòu)域保守性較高，鑒定到與CDPK激酶催化相關(guān)的保守序列C-E/A-G-G-E-L-F-D-R-I、H-R-D-L-K-P-E-N-F-L-F/L、D/E-V/I-V-G-S-P/A-Y-Y、A-P-E-V-L、D-V-W-S、G-V-M/I-L-Y-I-L-L、G-V-P-P-F-W、P-W-P-x-V/I-S、A-K-D-L-V以及H-P-W[20](圖3)，以及催化活性中心的核心氨基酸殘基Asp(圖3三角形所示)。

實(shí)線表示激酶結(jié)構(gòu)域的保守基序，三角形表示激酶結(jié)構(gòu)域的催化核心Asp殘基 Solid line indicates conserved motifs in kinase domain ofJ.curcasCDPK,the triangle indicates the core catalytic Asp residue in the kinase domain

圖3小桐子CDPK激酶結(jié)構(gòu)域多序列比對(duì)
Fig.3MultiplealignmentforconservedkinasedomainofJ.curcasCDPK

CDPK激酶調(diào)控區(qū)的EF-hand基序通過結(jié)合Ca2+從而解除自抑區(qū)對(duì)激酶結(jié)構(gòu)域的抑制作用，其中，Ca2+主要結(jié)合EF-hand基序的Asp(D)或Glu(E)，在小桐子CDPK激酶的調(diào)控區(qū)也鑒定到4個(gè)保守EF-hand基序(1st、2nd、3rd、4th EF-hand)，以及對(duì)應(yīng)的4個(gè)保守的序列D-x-D(圖4三角形所示)，另外發(fā)現(xiàn)每個(gè)EF-hand基序的保守D-x-D序列之后都包含富含Glu(E)的一段保守序列E-E-L-K(1st EF-hand)、E-E-I/L-A/T(2nd EF-hand)、D/E-E-L(3rd EF-hand)以及E-F-A/V-T/A-M-M(4th EF-hand)(圖4)。

虛線表示自抑區(qū)，實(shí)線表示4個(gè)EF-hand保守基序；雙實(shí)線表示EF-hand基序的核心序列；三角形表示EF-hand基序的保守D-x-D殘基 Dotted and solid lines show conserved motifs of auto-inhibitory and EF-hands ofJ.curcasCDP,respectively,the double lines and the triangles represent the core sequences and the conserved D-x-D residues in the EF-hand,respectively

圖4小桐子CDPK自抑區(qū)與EF-hand區(qū)多序列比對(duì)
Fig.4Multiplealignmentforconserveddomainsandmotifsinauto-inhibitoryandEF-handregionsofJ.curcasCDPK

2.4 小桐子CDPK及相關(guān)激酶基因家族染色體定位

依據(jù)Wu等[15]構(gòu)建的小桐子高密度遺傳連鎖圖譜，在染色體水平定位每個(gè)小桐子CDPK及相關(guān)激酶基因，結(jié)果表明，除11號(hào)染色體沒有基因分布外，28個(gè)小桐子CDPK及相關(guān)激酶基因(JcCRK4基因沒有染色體定位信息)不均勻地分布于其余10條染色體上，其中，6號(hào)染色體上的基因數(shù)量最多(6個(gè))，且發(fā)現(xiàn)該基因家族的串聯(lián)復(fù)制基因JcCDPK7/JcCDPK9，而1、2、3、4、7及10號(hào)染色體上的基因較少，各包含2個(gè)(圖5)。

2.5 小桐子CDPK及相關(guān)激酶家族基因的表達(dá)分析

基于小桐子葉片、根及種子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，得到小桐子29個(gè)CDPK及相關(guān)激酶基因的表達(dá)數(shù)據(jù)(圖6)。結(jié)果表明，29個(gè)CDPK及相關(guān)激酶基因，在葉片、根及種子中有24個(gè)基因都有表達(dá)，而3個(gè)基因都未鑒定到表達(dá)。其中，JcCDPK1、JcCDPK4、JcCDPK8、JcCDPK13及JcPEPRK1.2在3種器官中表達(dá)量都較高(log2FPKM>4.0)，但JcCDPK9、JcCDPK15及JcCDPK16在3個(gè)器官中都沒有表達(dá)(log2FPKM<0)。其他基因存在器官表達(dá)特異性，在葉片、根及種子中表達(dá)量最高的基因分別為JcCDPK13、JcCDPK4及JcPEPRK2.2。另外，JcCDPK7在葉片與種子中有表達(dá)，而在根中不表達(dá)，JcCCaMK在根中有表達(dá)，而在葉片與種子中沒有表達(dá)。

豎線表示基因串聯(lián)復(fù)制 Vertical line indicates tandem duplication；刻度表示厘摩 Scale is in centiMorgans (cM)；LG表示染色體 Chromosome

圖5小桐子CDPK及相關(guān)激酶家族基因的染色體定位
Fig.5ChromosomaldistributionofJ.curcasCDPKanditsrelatedgenefamily

通過DGE數(shù)據(jù)分析得到11個(gè)小桐子CDPK及相關(guān)激酶家族基因在低溫處理?xiàng)l件下的表達(dá)數(shù)據(jù)(圖7)。與對(duì)照相比，JcCDPK3在低溫脅迫12、24及48 h時(shí)都上調(diào)表達(dá)顯著，而JcPEPRK1.1與JcPEPRK2.2僅在低溫脅迫24 h上調(diào)表達(dá)顯著。另外，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，JcCDPK11、JcCRK3及JcCCaMK的表達(dá)量呈連續(xù)上升的趨勢(shì)，在低溫脅迫48 h時(shí)，表達(dá)量分別較對(duì)照提高4.23、7.41和2.25倍。聚類熱圖顯示，其他基因也屬于低溫誘導(dǎo)表達(dá)基因，其中，JcCDPK1在低溫脅迫24 h達(dá)到最大表達(dá)量，較對(duì)照提高1.56倍，而JcCDPK13、JcCDPK17、JcPPCK1及JcPPCK2都表現(xiàn)出2次上調(diào)表達(dá)峰值，分別在低溫脅迫48 h、12 h、48 h及12 h達(dá)到最大表達(dá)量。

圖6 小桐子CDPK及相關(guān)激酶家族基因的器官差異表達(dá)分析Fig.6 Differential expression of J.curcas CDPK and its related kinase gene family in different organs

3 討 論

有文獻(xiàn)[21]報(bào)道，在藻類與陸生植物分化之前CDPK家族基因就已經(jīng)分為4個(gè)亞族。雙子葉植物擬南芥[8]、楊樹[11]及小桐子，單子葉植物水稻[9]與玉米[10]的CDPK家族基因進(jìn)化分析結(jié)果也聚類為4個(gè)亞族，暗示CDPK基因功能的分化也是在單、雙子葉植物分化之前就已經(jīng)完成。另外，CDPK屬多基因家族，不同物種中數(shù)量差異較大，如單子葉植物水稻31個(gè)[9]、玉米40個(gè)[10]，雙子葉植物擬南芥34個(gè)[8]、楊樹30個(gè)[11]、草莓15個(gè)[22]、桃15個(gè)[23]。本研究鑒定的小桐子CDPK基因17個(gè)。從以上基因數(shù)量可以看出，CDPK家族基因在不同物種之間存在2倍關(guān)系。據(jù)報(bào)道[24]，在顯花植物進(jìn)化中，全基因復(fù)制事件是導(dǎo)致基因家族成員數(shù)目增加的重要途徑。以上結(jié)果也表明，大部分單子葉植物與部分雙子葉植物經(jīng)歷了一次全基因組復(fù)制事件，而雙子葉植物只有少數(shù)發(fā)生以上事件，且是在單雙子葉植物分化之后發(fā)生的，說明小桐子CDPK家族基因在單雙子葉植物分化之前就已聚為4類不同功能的亞族，而分化之后，未發(fā)生全基因組復(fù)制事件。另外，在經(jīng)歷全基因組復(fù)制的物種中還發(fā)現(xiàn)大量基因片段復(fù)制現(xiàn)象(Tandem duplication)，如水稻的OsCPK25/26(相似性99.6%)、OsCPK3/16(91.9%)、OsCPK2/14(86.8%)、OsCPK24/28(86.5%)及OsCPK1/15(86.2%)[9]，楊樹的PtCDPK2/3(相似性93.0%)、PtCDPK5/6(93.0%)、PtCDPK10/11(93.0%)、PtCDPK25/26(93.0%)、PtCCaMK1/2(93.0%)[11]等，而在雙子葉植物小桐子中只鑒定到JcCDPK7/JcCDPK9一對(duì)基因復(fù)制，也證明CDPK基因數(shù)量較多的植物在進(jìn)化中大部分發(fā)生了全基因組復(fù)制事件，導(dǎo)致大量相似性較高的CDPK基因出現(xiàn)，而未發(fā)生復(fù)制事件的植物如小桐子只有極少數(shù)的基因片段復(fù)制。另外，CRK、PEPRK基因家族在擬南芥[8]、水稻[9]與小桐子基因組中都有分布，而PPCK與CCaMK基因家族存在物種特異性，如PPCK基因家族在擬南芥與小桐子中都包含2個(gè)成員，而水稻中未鑒定到[9]，CCaMK基因家族在水稻與小桐子中都包含1個(gè)成員，而在擬南芥中未鑒定到[8]。

轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)顯示，小桐子CDPK及相關(guān)激酶基因有3種器官表達(dá)模式，第1類有顯著的器官表達(dá)特異性，如小桐子JcCDPK7在葉片與種子表達(dá)，而在根中沒有表達(dá)，JcCaMK在根中有表達(dá)，而在葉片與種子沒有表達(dá)，相同的研究結(jié)果在其他物種也有報(bào)道，如煙草NtCDPK1的轉(zhuǎn)錄本存在于莖、根及花中，而在葉片中未檢測(cè)到[25]，小麥TaCPK13在葉片、幼穗及未成熟的種子中表達(dá)，而在根與莖中不表達(dá)[26]。第2類在不同的器官中沒有顯著表達(dá)差異，如小桐子JcCDPK1、JcCDPK4、JcCDPK13、JcCRK1及JcCRK5在考察的3種器官中表達(dá)量基本一致，類似研究如番茄LeCDPK1在葉片、莖、根及花中表達(dá)量基本相同，小麥TaCPK2在葉片、莖、根、幼穗及未成熟的種子中表達(dá)量沒有差異[26]。另外，鑒定發(fā)現(xiàn)JcCDPK15與JcCDPK16在小桐子不同器官中都未表達(dá)。第3類為所有器官都有表達(dá)，但存在表達(dá)差異性，如蠶豆VfCPK1在各個(gè)器官都有表達(dá)，但在下表皮和葉片中的表達(dá)量顯著高于莖與根[27]，而小桐子的JcPPCK1在葉片、根及種子中都有表達(dá)，但葉片的表達(dá)量高于種子，JcCDPK14與JcPEPRK1.1在根與種子中表達(dá)量較高，而在葉片中較低(圖6)。以上3種表達(dá)模式暗示，部分小桐子CDPK及相關(guān)激酶基因?qū)儆诳醇一?，在所有器官中都發(fā)揮作用，且可能參與大部分代謝途徑或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程；相反，部分基因在特異器官或全部器官中都未見表達(dá)，推測(cè)可能是表達(dá)基因的同源基因，也可能是通過生物或非生物因子誘導(dǎo)才能表達(dá)的基因。同時(shí)，多數(shù)CDPK及相關(guān)激酶基因與植物逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。Sheen[28]發(fā)現(xiàn)擬南芥AtCDPK1與AtCDPK1a在干旱與鹽脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)。而本研究中JcCDPK3、JcCDPK11、JcCRK3及JcCCaMK在低溫脅迫下表達(dá)量增加明顯，屬于小桐子抗冷性及低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因(圖7)。

圖7 小桐子CDPK及相關(guān)激酶家族基因的低溫脅迫表達(dá)分析Fig.7 Expression profiles of J.curcas CDPK and its related kinase gene family under chilling stress