鐵皮石斛、流蘇石斛及紫皮石斛中總多糖含量測(cè)定研究

陳丹 吳梅青 張廣寧 李金科 李柯

【摘?要】?目的：建立鐵皮石斛、流蘇石斛及紫皮石斛中總多糖的含量測(cè)定方法。方法：采用紫外分光光度法，以無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品，在483nm波長(zhǎng)處測(cè)定鐵皮石斛、流蘇石斛及紫皮石斛中總多糖的含量。結(jié)果：無(wú)水葡萄糖在1.742～12.191μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，r=0.999?3;平均回收率為99.8%，RSD為3.29%。鐵皮石斛中總多糖含量在35.64～39.39g·100g-1之間，流蘇石斛總多糖含量在9.25～12.82g·100g-1之間，紫皮石斛總多糖含量在32.57～37.27g·100g-1之間。結(jié)論：不同品種含量差異較大，采用紫外分光光度法測(cè)定石斛中總多糖含量的方法操作簡(jiǎn)便、快速，具有較好的專屬性和準(zhǔn)確性。

【關(guān)鍵詞】?鐵皮石斛;流蘇石斛;紫皮石斛;無(wú)水葡萄糖;紫外分光光度法

【中圖分類號(hào)】R284.1?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】?A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）22-0050-05

Content?Determination?of?Total?Polysaccharides?in?Dendrobium?Officinale，

Dendrobium?Fimbriatum?and?Dendrobium?Devoninum

CHEN?Dan1?WU?Meiqing1?ZHANG?Guangning1?LI?Jinke1?LI?Ke2*

1.Xiangtan?Medicine?Health?Vocational?College，??Xiangtan?411102，China;

2.Hunan?Academy?of?Traditional?Chinese?Medicine，??Changsha?410013，China

Abstract：Objective??To?establish?a?method?for?content?determination?of?total?polysaccharides?in?Dendrobium?officinale，?Dendrobium?fimbriatum?and?Dendrobium?devoninum.?Methods?The?content?of?total?polysaccharides?in?Dendrobium?officinale，?Dendrobium?fimbriatum?and?Dendrobium?devoninum?was?determined?by?ultraviolet?spectroscopy?with?anhydrous?glucose?as?reference?substance?at?483nm?wavelength.?Results?Anhydrous?glucose?showed?good?linearity?in?the?range?of?1.742～12.191?μg·mL-1（r=0.999?3），?and?the?average?recovery?rate（n=6）of?the?anhydrous?glucose?was?99.8%，?and?RSD?was?3.29%.?The?content?ranges?of?polysaccharides?in?Dendrobium?officinale，?Dendrobium?fimbriatum?and?Dendrobium?devoninum?in?different?batches?were?35.64～39.39?g·100g-1，?9.25-12.82?g·100g-1，?32.57-37.27?g·100g-1.?Conclusion?There?was?large?difference?in?content?of?different?varieties，?the?method?of?determining?the?total?polysaccharide?content?in?Dendrobium?by?ultraviolet?spectrophotometry?is?simple?and?rapid，?and?has?good?specificity?and?accuracy.

Keywords：Dendrobium?officinale;?Dendrobium?fimbriatum;?Dendrobium?devoninum;?Anhydrous?glucose;?Ultraviolet?Spectroscopy

中藥石斛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，具有益胃生津，滋陰清熱等功效。2015版《中藥藥典》中規(guī)定石斛為蘭科植物金釵石斛Dendrobium?nobile?Lindl.、鼓槌石斛Dendrobium?chrysotoxum?Lindl.或流蘇石斛Dendrobium?fimbriatum?Hook.的栽培品及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖。另外，蘭科植物鐵皮石斛Dendrobium?officinale?Kimura?et?Migo由于使用廣泛，且野生資源稀缺，人工栽培成本高，日漸成為了名貴的中藥品種[1-2]。藥材市場(chǎng)上多有不法商販以同屬其它植物進(jìn)行冒充，如蘭科植物紫皮石斛D.?devouianum由于在外形上與鐵皮石斛極為相似，但價(jià)格又遠(yuǎn)低于鐵皮石斛，多被用于冒充鐵皮石斛來(lái)銷售和使用[3-4]。石斛在臨床上常用于緩解人體疲勞、增強(qiáng)免疫力、改善胃腸道功能、治療糖尿病與輔助抗腫瘤等[5-9]，現(xiàn)代研究表明，石斛的藥理作用與其所含多糖有著密切關(guān)聯(lián)。本研究以葡萄糖為對(duì)照品，采用紫外分光光度法對(duì)3個(gè)不同品種多批次的石斛中總多糖含量進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步了解不同石斛中總多糖的差異。

1?儀器與材料

1.1?儀器?UV-2450型紫外分光光度計(jì)（日本，島津）、METTLER?AE240型分析天平（瑞士METTLER）、HX-06超聲波清洗器（武漢市恒信世紀(jì)科技有限公司）、80-2離心沉淀器（上海手術(shù)器械廠）、DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2?藥材與試藥?試藥：無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)110833-201205，含量為99.5%，供含量測(cè)定用）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;所用試劑均為分析純;純凈水：華潤(rùn)怡寶飲料（中國(guó)）有限公司提供。

藥材：鐵皮石斛藥材經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院李若存研究員鑒定為蘭科植物鐵皮石斛Dendrobium?officinale?Kimura?et?Migo的干燥莖;紫皮石斛藥材經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院李若存研究員鑒定為蘭科植物紫皮石斛Dendrobium?devouianum的干燥莖;流蘇石斛藥材經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院李若存研究員鑒定為蘭科植物流蘇石斛Dendrobium?fimbriatum?Hook.的干燥莖。樣品來(lái)源見表1。

2?總多糖含量測(cè)定[10-12]

2.1?對(duì)照品溶液的制備?精密稱取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，加水制成每1mL含0.1mg的溶液，搖勻，即得。

2.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備?精密量取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.4mL，分別置10mL具塞試管中，各加水補(bǔ)至2.0mL，精密加入5%苯酚溶液1mL，搖勻，精密加入硫酸10mL，搖勻，置沸水浴（98～100℃）中加熱15min，取出，置冰浴中冷卻5min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0401），在483nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果見表2。

以無(wú)水葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程為y=0.0457x+0.0536，r=0.999?3，結(jié)果表明無(wú)水葡萄糖在濃度1.742～12.191μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度值呈良好良性關(guān)系。

2.3?測(cè)定波長(zhǎng)的選擇?精密量取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液1mL，置10mL具塞比色管中，精密加入5%苯酚溶液1mL，搖勻;精密加入濃硫酸10mL，搖勻，置沸水浴中加熱15min，取出，立即置冰浴冷卻，于400～700nm進(jìn)行掃描，得最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在483nm處有最大吸收，故選擇483nm波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。如圖1所示。

2.4?供試品溶液的制備?取鐵皮石斛粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.5?g，精密稱定，加水?200?mL，加熱回流?2?h，放冷，轉(zhuǎn)移至250?mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液?2?mL，置?15?mL離心管中，精密加入無(wú)水乙醇8mL，搖勻，冷藏1h，取出，離心（4000轉(zhuǎn)/min）10min，棄去上清液（必要時(shí)濾過(guò)），沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8?mL，離心，棄去上清液，沉淀以2?mol·L-1的硫酸5?mL溶解，轉(zhuǎn)移至25?mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.5?測(cè)定?精密量取供試品溶液1?mL，置10?mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1?mL”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的量，計(jì)算，即得。

2.6?精密度試驗(yàn)?精密量取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液1?mL，置10?mL具塞試管中，加水補(bǔ)至2.0?mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1?mL”起，依法測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸光度值，計(jì)算吸光度值的RSD為0.86%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取鐵皮石斛（批號(hào)：201603009）適量，按“2.4供試品溶液制備”項(xiàng)下的方法制備，并依“2.5測(cè)定”項(xiàng)下的方法分別于0、2、4、6、8、12?h測(cè)定吸光度值，計(jì)算吸光度值的RSD。結(jié)果表明，供試品溶液在?12?h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見表3。

2.8?重復(fù)性試驗(yàn)?取鐵皮石斛（批號(hào)201603009）適量，按“2.4供試品溶液制備”項(xiàng)下的方法制備6份溶液，并依“2.5測(cè)定”項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算總多糖含量，結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。見表4。

2.9?回收率試驗(yàn)?取鐵皮石斛粉末（批號(hào)201603009），取約0.25g，精密稱定，平行6份，加水200mL，加熱回流2h，放冷，轉(zhuǎn)移至250mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2mL，分別置15mL離心管中，精密加入無(wú)水乙醇8mL，搖勻，冷藏1h，取出，離心（4000轉(zhuǎn)/min）10min，棄去上清液，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8mL，離心，棄去上清液，向沉淀中加入無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液（0.85mg/mL）1.0mL，再以2mol·L-1的硫酸5mL溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。并依“2.5測(cè)定”項(xiàng)下的方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算葡萄糖回收率。結(jié)果見表5。

2.10?樣品含量測(cè)定?分別取鐵皮石斛、紫皮石斛與流蘇石斛適量，粉碎過(guò)三號(hào)篩，紫皮石斛取約0.5g、鐵皮石斛取約0.5g、流蘇石斛取約2g，精密稱定，分別按“2.4供試品溶液制備”項(xiàng)下的方法制備，并依“2.5測(cè)定”方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算總多糖含量。結(jié)果見表6。

3?討論

本試驗(yàn)所測(cè)定的3種石斛中，紫皮石斛中總多糖含量與鐵皮石斛差異較小，含量均超過(guò)藥典中鐵皮石斛中多糖的規(guī)定，而流蘇石斛含量最低。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明鐵皮堿石斛與紫皮石斛多糖含量相近，從多糖具有緩解人體疲勞、增強(qiáng)免疫力、改善胃腸道功能、治療糖尿病與輔助抗腫瘤等作用考慮，紫皮石斛同樣具有開發(fā)利用前景，但紫皮石斛是否可以替代鐵皮石斛入藥，然需要進(jìn)一步進(jìn)行藥效與化學(xué)成分對(duì)比研究。本實(shí)驗(yàn)中3種石斛不同批次間多糖含量有差異，是因?qū)嶒?yàn)采集的樣品來(lái)源于不同的產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境、生長(zhǎng)年限均不同。

供試品溶液的制備過(guò)程中，比較了取樣量（0.25?g、0.5?g、1?g、2?g、3?g），取樣量為0.25?g時(shí)，吸收值小于0.3，取樣量為0.5～3?g時(shí)，吸收值在0.3～0.7之間，但取樣量為2?g和3?g時(shí)，多糖含量反而減少，分析原因可能是顯色劑達(dá)到飽和，因此紫皮石斛與鐵皮石斛取樣量以0.5?g合適，但流蘇石斛因多糖含量較低，為了確保吸收值在線性范圍內(nèi)，計(jì)算準(zhǔn)確，因此取樣量以?2?g?為宜。同時(shí)比較了回流時(shí)間（1?h、2?h、3?h、4?h），提取1?h多糖含量較低，3?h、4?h與2?h多糖含量無(wú)差別，但耗能多，因此選擇回流2?h。

加樣回收率試驗(yàn)中，鐵皮石斛藥材中加入一定量無(wú)水葡萄糖按供試品溶液制備、測(cè)定，結(jié)果無(wú)水葡萄糖的的回收率僅40%～50%，分析原因是制備過(guò)程中沉淀加80%乙醇洗滌2次，無(wú)水葡萄糖因溶于80%乙醇而損失，因此將無(wú)水葡萄糖直接加入到沉淀中定容后再進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

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（收稿日期：2019-09-12?編輯：劉?斌）