仔豬黃痢大腸桿菌的分離鑒定

劉澤文 袁芳艷 劉威 高婷 周丹娜 楊克禮 段正贏 郭銳 梁婉 田永祥

摘要：湖北省紅安縣某豬場(chǎng)新生仔豬發(fā)生一種以劇烈腹瀉、排出黃色糞便并迅速脫水死亡為主要癥狀的疾病，經(jīng)病原分離、革蘭氏染色、PCR鑒定、生化試驗(yàn)和血清型鑒定，確定新生仔豬病是由大腸桿菌感染引起。經(jīng)血清型鑒定，該分離菌株屬于纖毛抗原987P型，該菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟較敏感。

關(guān)鍵詞：仔豬黃痢;大腸桿菌;分離鑒定

中圖分類號(hào)：S828;S855.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）23-0142-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.034? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation and identification of Escherichia coli from yellow diarrhea in piglets

LIU Ze-wen，YUAN Fang-yan，LIU Wei，GAO Ting，ZHOU Dan-na，YANG Ke-li，

DUAN Zheng-ying，GUO Rui，LIANG Wan，TIAN Yong-xiang

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Hubei Academy of Agricultural Science/Key Laboratory of Prevention and Control Agents for Animal Bacteriocins，Ministry of Agriculture and Aural Affairs，Wuhan 430064，China）

Abstract： In a pig farm in Hong'an county， Hubei province， newborn piglets developed a disease characterized by severe diarrhea， discharge of yellow feces and rapid dehydration; after pathogen isolation， Gram staining， PCR identification， biochemical tests and serotype identification， E. coli infection in newborn piglets was determined. According to the serotype identification， the isolated strain belongs to the cilia antigen 987P type， and the strain is sensitive to ceftriaxone and cefotaxime.

Key words： piglet scutellaria; Escherichia coli; isolation and identification

2018年上半年，湖北紅安縣某豬場(chǎng)1～3日齡的新生仔豬出現(xiàn)拉黃色水樣稀糞，內(nèi)含凝乳小片，病仔豬消瘦、脫水，最后因衰竭而死亡。經(jīng)過(guò)臨床解剖、病原分離鑒定、生化鑒定確定為仔豬黃痢大腸桿菌感染。

1? 材料與方法

培養(yǎng)基：麥康凱瓊脂平板、改良Minca湯、糖發(fā)酵等培養(yǎng)基，按常規(guī)方法配制。

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸桿菌C83710菌株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

單因子血清：K88、K99、987P和F41纖毛單因子血清由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。

病料采集：采集湖北紅安縣某發(fā)病豬場(chǎng)發(fā)病仔豬的黃色稀糞。

細(xì)菌的培養(yǎng)：將發(fā)病豬的黃色稀糞接種麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16～20 h后，挑選單個(gè)紅色菌落，再接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～20 h后進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

細(xì)菌鏡檢：挑選麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落，經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

細(xì)菌PCR鑒定：參照NY/T 2839-2015[1]合成PCR引物。

K88：K88-F? GATGAAAAAGACTCTGATTGCA

-841bp;K88-R? GATTGCTACGTTCAGCGGAGCG。

K99：K99-F? CTGAAAAAAACACTGCTAGCTA

TT-543bp;K99-R? CATATAAGTGACTAAGAAGGA

TGC。

987P：987P-F? GTTACTGCCAGTCTATGCCAA

GTG-463bp;987P-R? TCGGTGTACCTGCTGAACGA

ATAG。

F41：F41-F? GATGAAAAAGACTCTGATTGCA

-682bp;F41-R? TCTGAGGTCATCCCAATTGTGG。

擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s;52 ℃ 30 s;72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

細(xì)菌纖毛抗原血清型鑒定：將PCR陽(yáng)性菌株分別接種改良Minca湯培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)8～10 h，分別取樣與K88、K99、987P和F41纖毛單因子血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，鑒定菌株的纖毛抗原型。

細(xì)菌生化試驗(yàn)：將PCR擴(kuò)增呈陽(yáng)性的大腸桿菌接種改良Minca湯，37 ℃振搖培養(yǎng)8～10 h，分別接種糖發(fā)酵和其他生化試驗(yàn)培養(yǎng)基小管，每管0.2 mL，37 ℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

細(xì)菌藥敏試驗(yàn)：將分離純化的菌株按常規(guī)方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[2]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 形態(tài)、染色特性

臨床發(fā)病仔豬病狀見(jiàn)圖1，分離菌株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈典型紅色菌落（圖2），改良Minca湯8～10 h培養(yǎng)物涂片，革蘭氏染色，均為革蘭氏陰性小桿菌（圖3）。

2.2? PCR鑒定

分離菌株用987P引物擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，K88、K99和F41引物均未擴(kuò)增出條帶（圖4），鑒定該分離菌株纖毛抗原為987P型。

2.3? 血清型鑒定

分離菌株改良Minca湯培養(yǎng)物與987P纖毛單因子血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)凝集，而與K88、K99和F41纖毛單因子血清均未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，證明該分離菌株纖毛抗原為987P型。

2.4? 生化鑒定

按常規(guī)方法進(jìn)行生化鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5? 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果（表2）表明，分離的大腸桿菌對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟較敏感，對(duì)頭孢呋辛、卡那霉素和阿米卡星有一定敏感性，對(duì)其余藥物表現(xiàn)為耐藥。

3? 小結(jié)與討論

1）根據(jù)新生仔豬的臨床發(fā)病癥狀、病原分離、革蘭氏染色、PCR鑒定、生化鑒定和血清型鑒定結(jié)果，確定仔豬病是由仔豬大腸桿菌987P血清引起的新生仔豬大腸桿菌?。ㄗ胸i黃?。?。

2）新生仔豬大腸桿菌腹瀉，即仔豬黃痢，是出生后幾小時(shí)到1周齡仔豬的一種急性高度致死性腸道傳染病，以劇烈腹瀉、排出黃色或黃白色水樣糞便以及迅速脫水死亡為特征。引起新生仔豬大腸桿菌腹瀉的致病菌稱為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC），該菌利用菌毛黏附素，如F4（K88）、F5（K99）F6（987P）或F41吸附在新生仔豬小腸黏膜上，產(chǎn)生腸毒素，如STa（STI）、STb（STII）或LT，這些腸毒素致使仔豬小腸中的水分和電解質(zhì)的量發(fā)生改變，引起仔豬發(fā)生腹瀉[3]。

3）由于新生仔豬大腸桿菌感染仔豬日齡小，病程急，死亡快，一般發(fā)病后藥物治療效果不理想。母源性免疫是控制新生仔豬ETEC腹瀉最有效的手段之一，通過(guò)對(duì)懷孕母豬接種疫苗，新生仔豬通過(guò)吸食初乳而獲得免疫保護(hù)力。目前中國(guó)已研制成功了大腸桿菌（K88、K99、987P）和產(chǎn)氣莢膜梭菌（C型）二聯(lián)滅活疫苗[4]、新生仔豬大腸桿菌K88、K99雙價(jià)基因工程菌苗以及仔豬大腸桿菌腹瀉K88、K99、987P三價(jià)滅活疫苗等[5]，均具有較好的免疫效果。同時(shí)還應(yīng)該加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善母豬的飼料質(zhì)量和搭配，母豬產(chǎn)房應(yīng)保持清潔干凈，仔豬盡早吃上初乳，保持仔豬生活環(huán)境較舒適的溫度等。

參考文獻(xiàn)：

[1] NY/T 2839-2015，致仔豬黃痢大腸桿菌分離鑒定技術(shù)[S].

[2] 倪語(yǔ)星，尚? 紅.臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)[M].第四版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.

[3] JEFFREY J，ZIMMERMAN，LOCKE A，et al.豬病學(xué)[M].第十版.趙德明，張仲秋，周向梅，等，譯.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2014.

[4] 劉澤文，袁芳艷，劉? 威，等.仔豬大腸桿菌病、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病二聯(lián)滅活疫苗的研制與應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2018，37（6）：24-28.

[5] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2015.