烏飯樹葉中粗黃酮的提取及抗氧化性研究

滿洋　劉富康　曲映紅

摘 要：以80%乙醇溶液浸提干燥的烏飯樹葉，用分光光度法測(cè)定提取液中的粗黃酮含量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了烏飯樹葉粗黃酮的提取工藝。結(jié)果表明，粗黃酮最佳提取條件為：提取時(shí)間2h、提取溫度80℃、料液比1∶15，提取率最高達(dá)2.79%?？寡趸囼?yàn)的結(jié)果顯示烏飯樹葉粗黃酮有較高的DPPH自由基清除能力，是一種良好的天然抗氧化劑。

關(guān)鍵詞：烏飯樹葉；黃酮；提取工藝；抗氧化性

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）19-0015-03

Study on Extraction and Antioxidant Activity of Crude Flavonoids from Vaccinium bracteatum Thunb. Leaves

Man Yang et al.

（Shanghai Ocean University，National Experimental Teaching Demonstration Center for Food Science and Engineering，Shanghai 201306）

Abstract：In this study，crude flavonoids was extracted from Vaccinium bracteatum Thunb. leaves with 80% ethanol and its content was determined by spectrophotometry. On the basis of single factor experiment，the extraction process of crude flavonoids from Vaccinium bracteatum Thunb. leaves was optimized by orthogonal test. The optimum extraction conditions were as follows：the extraction time was 2h，the extraction temperature was 80℃，the solid-liquid ratio was 1：15，the extraction rate of flavonoids was 2.79%. The result of antioxidant activity experiment showed that the crude flavonoids has high DPPH free radical scavenging capacity.Vaccinium bracteatum Thunb.leaves is a good source of natural antioxidants.

Key words：Vaccinium bracteatum Thunb.leaves；Flavonoids；Extraction technology；Antioxidant activity

烏飯樹又名南燭，因江南地區(qū)的人們有用其葉蒸烏飯食用的習(xí)俗而得名，屬杜鵑花科常綠灌木，主要分布于長(zhǎng)江以南各省區(qū)。藥用歷史悠久，其葉汁含有天然黑色素，具有松弛血管、改善血液循環(huán)的作用，也可以預(yù)防動(dòng)脈硬化、糖尿病等[1]。烏飯樹葉提取物主要以黃酮類和多酚類為主，還含有少量的維生素、糖類、蛋白質(zhì)等其他成分[2]。有資料顯示烏飯樹葉的黃酮類提取物具有一定的抗氧化作用[3-4]。本文研究了烏飯樹葉粗黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力，旨在為開(kāi)發(fā)綠色安全的天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 烏飯樹葉：2016年11月購(gòu)于湖北武漢。試劑：DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），乙醇，蘆丁，抗壞血酸，硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉等，所用試劑均為分析純。儀器：AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LLJ-306Z粉碎機(jī)，江門市貝爾斯頓電器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KQ5200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；LGJ-10臺(tái)式冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；752N分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗黃酮含量的測(cè)定 參照王芳和LONDONO[5-6]的方法，并做些許改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取40mg蘆丁，用80%乙醇溶解，定容至50mL容量瓶中。取5個(gè)25mL比色管，分別加入0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL蘆丁溶液，各管中加入3.0mL80%乙醇溶液和0.5mL5%亞硝酸鈉溶液，混勻后靜置6min，加入0.5mL10%硝酸鋁溶液，混勻后靜置6min，再加入4.0mL5%氫氧化鈉溶液，混勻后靜置15min，用80%乙醇定容，以未加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的1管作空白對(duì)照，測(cè)定波長(zhǎng)510nm處的吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取10g粉碎并烘干的烏飯樹葉，80%乙醇超聲浸提，5000r離心5min，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中用80%乙醇定容，得到烏飯樹葉粗黃酮提取液，按上述方法測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算粗黃酮得率。

1.2.2 烏飯樹葉粗黃酮提取工藝優(yōu)化 通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察提取時(shí)間（1、1.5、2、2.5h）、提取溫度（50、60、70、80℃）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）3個(gè)因素對(duì)烏飯樹葉提取物中粗黃酮得率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（33）正交試驗(yàn)，以烏飯樹葉提取物中粗黃酮的得率為考察指標(biāo)，對(duì)提取時(shí)間、料液比和提取溫度3個(gè)影響因素進(jìn)行綜合考察，進(jìn)一步優(yōu)化烏飯樹葉中粗黃酮的提取工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表1所示。

1.2.3 烏飯樹葉提取物抗氧化性測(cè)定（DPPH法） 按1.2.2中正交試驗(yàn)獲得的最佳提取工藝進(jìn)行浸提，離心后的上清液減壓濃縮后，冷凍干燥獲得烏飯樹葉粗黃酮提取物。將濃度分別為20mg·L-1，25mg·L-1，30mg·L-1，35mg·L-1，40mg·L-1，45mg·L-1的粗黃酮和Vc系列溶液按照勾明玥和方敏[7-8]的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定樣品和空白反應(yīng)混合物在517nm處的吸光度，根據(jù)下列公式計(jì)算清除率：

K（%）=[1-（A1–A2）/A0]×100

式中，K為樣品對(duì)DPPH自由基的清除率，A1為DPPH溶液加樣品液后的吸光度，A2為樣品液在測(cè)定波長(zhǎng)的吸光度，A0為DPPH溶液不加樣品液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 經(jīng)線性回歸得出蘆丁濃度與吸光度值關(guān)系曲線的回歸方程為y=0.026x+0.001，R2=0.999。該方法線性關(guān)系良好，可以用來(lái)測(cè)定烏飯樹葉提取物中粗黃酮的得率。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)粗黃酮得率的影響 由圖1可知，從0.5h開(kāi)始，隨提取時(shí)間的增加，粗黃酮的得率隨之上升，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到1.5h時(shí)，得率達(dá)到最高；繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，粗黃酮的得率反而下降，這可能是由于已溶出的粗黃酮在持續(xù)高溫條件下遭到破壞所致[9]。

2.2.2 料液比對(duì)粗黃酮得率的影響 由圖2可以看出，隨著溶劑使用量的增加，粗黃酮的得率也隨之升高。料液比為1∶20時(shí)，粗黃酮的得率達(dá)到最高，再增加溶劑量，得率下降。這可能是由于溶劑繼續(xù)增加時(shí)，導(dǎo)致了其他脂溶性物質(zhì)的增多[10]，不利于粗黃酮的提取。

2.2.3 提取溫度對(duì)粗黃酮得率的影響 由圖3可知，粗黃酮的得率隨提取溫度的升高而增大。當(dāng)溫度為80℃時(shí)，得率達(dá)到最大，這可能是由于溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，從而使黃酮的溶解度不斷增大；高溫條件下細(xì)胞膜易破損，有利于粗黃酮從組織細(xì)胞轉(zhuǎn)移到提取溶劑中[11]。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 由單因素試驗(yàn)得到最好的3個(gè)水平分別為提取溫度：60、70、80℃；提取時(shí)間：1、1.5、2h；料液比：1∶15、1∶20、1∶25，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。由表2可知，最佳的提取工藝為A3B3C1，即提取溫度80℃，提取時(shí)間2h，料液比1∶15時(shí)烏飯樹葉提取物中粗黃酮得率最高。通過(guò)表2的極差R分析，三者對(duì)粗黃酮得率的影響度為A>C>B，即提取溫度>料液比>提取時(shí)間。

在A3B3C1的最佳提取工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明：重復(fù)提取3次，粗黃酮得率平均值為（2.79±0.01）%，因此正交試驗(yàn)的結(jié)果是準(zhǔn)確和穩(wěn)定的。

2.4 抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果 由圖4可以看出，烏飯樹葉粗黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的提高而上升，雖然低于相同濃度Vc對(duì)DPPH自由基的清除率，但依然達(dá)到了70%以上的較高水平。

3 結(jié)論

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化烏飯樹葉中粗黃酮的提取工藝，得到最佳的提取條件為提取時(shí)間2h、提取溫度80℃、料液比1∶15，該條件下粗黃酮的最大得率為2.79%。

烏飯樹葉粗黃酮具有較高的DPPH自由基清除率，是一種良好的天然抗氧化劑，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

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（責(zé)編：張宏民）