黃芪多糖對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分化中IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路的影響

張艷輝 駱亞莉 劉永琦 王磊 許小敏 馮彩琴 李研

摘要：目的??觀察黃芪多糖（APS）在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（TAFs）分化中對IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路的影響，探討其可能的調(diào)控機(jī)制。方法??以白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)BMSCs，建立向TAFs方向分化的炎性微環(huán)境模型;采用CCK-8法分別檢測不同濃度IL-6/STAT3通路阻斷劑AG490和TNF-α/NF-κB通路阻斷劑BMS345541對BMSCs和誘導(dǎo)后BMSCs增殖能力的影響，Western blot檢測阻斷劑所對應(yīng)的靶向蛋白JAK2和IKKβ的表達(dá)。將BMSCs分為空白組、模型組、模型+AG490組、模型+BMS345541組、模型+APS組，檢測各組TAFs標(biāo)記分子α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）和IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路關(guān)鍵蛋白STAT3、p65的表達(dá)。結(jié)果??與空白組比較，模型組BMSCs增殖水平明顯增強(qiáng)（P<0.05）;10?μmol/L AG490和5?μmol/L BMS345541較模型組BMSCs抑制作用明顯增強(qiáng)（P<0.05）。10?μmol/L AG490對應(yīng)的靶蛋白JAK2較其他各組表達(dá)減弱，5?μmol/L BMS345541對應(yīng)的靶蛋白IKKβ較其他各組表達(dá)減弱，故選為最佳作用濃度。通路阻斷劑干預(yù)結(jié)果表明，與空白組比較，模型組TAFs標(biāo)記分子α-SMA、FAP和通路關(guān)鍵蛋白STAT3、p65表達(dá)均明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，各干預(yù)組TAFs標(biāo)記分子α-SMA、FAP和通路蛋白STAT3、p65表達(dá)均明顯下降（P<0.05）。結(jié)論??APS對IL-6、TNF-α誘導(dǎo)的BMSCs向TAFs方向分化有抑制作用，其機(jī)制可能與調(diào)控IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：黃芪多糖;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞;IL-6/STAT3通路;TNF-α/NF-κB通路;通路阻斷劑

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.013

中圖分類號：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2018）10-0054-06

Effects of Astragalus Polysaccharides on Pathways?of IL-6/STAT3 and TNF-α/NF-κB in Process of Differentiation from?BMSCs to TAFs

ZHANG Yan-hui， LUO Ya-li， LIU Yong-qi， WANG Lei， XU Xiao-min， FENG Cai-qin， LI Yan

Gansu University of Chinese Medicine， Provincial Key Laboratory of Major Disease Prevention and Control of Molecular Medicine and Traditional Chinese Medicine Research in Gansu Province， Key Laboratory of Dunhuang Medicine and Transformation at Provincial and Ministerial Level， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To observe the effects of Astragalus polysaccharides?（APS）?on pathways of IL-6/STAT3 and TNF-α/NF-κB in the process of differentiation from bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） to?tumor-associated fibroblasts （TAFs）; To discuss the possible regulatory mechanism. Methods BMSCs was induced by IL-6 and TNF-α， and an inflammatory microenvironment model which differentiated into TAFs direction was established. CCK-8 method was used to detect the effects of different concentrations of IL-6/STAT3 pathway blocker AG490 and TNF-α/NF-κB pathway blocker BMS345541 on BMSCs and its proliferation after induction. Target protein expressions of JAK2 and IKKβ?corresponding to blocker were detected by Western blot. BMSCs were divided into blank group， model group， model+AG490 group， model+BMS345541 group， and model+APS group; expressionsof α-SMA and FAP of TAFs marker molecules and the key proteins of STAT3 and p65 of IL-6/STAT3 and TNF-α/NF-κB pathway were detected. Results Compared with the blank group， the proliferation ability of the model group increased?significantly （P<0.05）; Compared with the model group， 10?μmol/L AG490 and 5?μmol/L BMS345541 had a strong inhibitory effect on the proliferation ability （P<0.05）. The expression of JAK2， a target protein corresponding to 10?μmol/L AG490， was weaker than that of other groups. The target protein IKKβ?corresponding to 5?μmol/L BMS345541 was weaker than the other groups， so it was selected as the best concentration. The results of pathway intervening blockers showed that compared with the blank group， the expressions of TAFs makers α-SMA and FAP， and key proteins STAT3 and p65 of pathway in the model group increased significantly （P<0.05）; Compared with model group， the expressions of TAFs makers α-SMA and FAP， and key proteins STAT3 and p65 of pathway in other groups decreased significantly （P<0.05）. Conclusion APS?has inhibitory effects on the differentiation of BMSCs into TAFs induced by IL-6 and TNF-α， and its mechanism may be related to the regulation of pathways of IL-6/STAT3 and TNF-α/NF-κB.

Keywords：Astragalus polysaccharides; bone marrow mesenchymal stem cells; tumor-associated fibroblasts; IL-6/STAT3 pathway; TNF-α/NF-κB pathway; pathway blocker

近年來我國惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢^[1]，因此對腫瘤的防治刻不容緩。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）具有低免疫原性、多向分化的潛能，有抗腫瘤作用。有研究顯示，干細(xì)胞微環(huán)境異?？墒笲MSCs發(fā)生遺傳穩(wěn)定性的變化甚至分化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（tumor-?associated fibroblasts，TAFs）^[2-3]。在這一過程中，白細(xì)胞介素-6（IL-6）介導(dǎo)的STAT3通路^[4]和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）介導(dǎo)的核因子-κB（NF-κB）^[5]通路可能扮演重要的角色。因此，阻斷與TAFs相關(guān)的因子或信號通路^[6]有望成為應(yīng)用BMSCs靶向治療腫瘤的新方式。黃芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS）是黃芪的主要成分之一。本課題組前期研究表明，APS可抑制肺癌微環(huán)境中BMSCs增殖的異常改變和維護(hù)其所處微環(huán)境及自身的穩(wěn)定^[7]。本實驗通過阻斷與異常分化密切相關(guān)的通路，探討APS對炎性微環(huán)境中BMSCs向TAFs方向分化的可能調(diào)控機(jī)制。

1 ?實驗材料

1.1 ?藥物、細(xì)胞和培養(yǎng)

APS（批號ZD1219LA13），上海源葉生物;BMSCs細(xì)胞株（編號7500），美國ScienCell公司。將BMSCs用MSCM培養(yǎng)基培養(yǎng)于5%CO₂、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每2～3 d換液1次。待細(xì)胞融合度達(dá)80%后，0.25%胰蛋白酶消化傳代，第3代細(xì)胞用于實驗。

1.2 ?主要試劑與儀器

0.25%胰蛋白酶（批號J170024），Hyclone公司; CCK-8試劑盒（批號170832），上海尚寶生物科技有限公司;人IL-6（批號031316 D1315），PEPRO TECH公司;人TNF-α（批號0607B25 G2516），PEPRO TECH公司;AG490（批號18826），MCE公司;BMS345541（批號8419），MCE公司;兔抗人IKK-β多克隆抗體（批號GR322133-5），Abcam公司;兔抗人JAK2多克隆抗體（批號GR312865-2），Abcam公司;兔抗人GAPDH多克隆抗體（批號AB-P-R001），杭州賢至生物公司;兔抗人α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）多克隆抗體（批號42046），GeneTex公司;兔抗人成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）多克隆抗體（批號YT0845），ImmunoWay公司;兔抗人STAT3多克隆抗體（批號39953），GeneTex公司;兔抗人p65多克隆抗體（批號41556），GeneTex公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號B0201），ImmunoWay公司。CO₂培養(yǎng)箱（型號MCO-18AIC），日本三洋電機(jī)公司;Countstar自動細(xì)胞計數(shù)儀（型號IC1000），上海睿鈺生物科技有限公司;酶標(biāo)儀（型號IMARK），美國BIO-RAD公司;倒置相差顯微鏡（型號IX81），日本OLYMPUS公司;凝膠成像分析系統(tǒng)（型號Chemi Doc），美國BIO-RAD公司。

2 ?實驗方法

2.1 ?分組

將BMSCs分為空白組、模型組、模型+AG490組、模型+BMS345541組、模型+APS組。取第3代狀態(tài)良好的BMSCs，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10⁴個/mL的單細(xì)胞懸液，每孔2 mL接種于6孔板內(nèi)。除空白組外，分別以IL-6 100 ng/mL和TNF-α 50?ng/mL進(jìn)行干預(yù)。每3?d換液1次，每次換液補(bǔ)充新的IL-6和TNF-α，每7?d傳代1次，連續(xù)誘導(dǎo)42?d后作為模型組細(xì)胞用于后續(xù)實驗。各組細(xì)胞倒置相差顯微鏡鏡下觀測并采集細(xì)胞生長狀況。

2.2 ?CCK-8法檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖

將融合度約為85%的BMSCs用0.25%胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，以2×10³/孔接種于5個96孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度（10、5、2.5 μmol/L）的AG490和BMS345541，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，分別于24、48、72、96、120 h后每孔加10 μL CCK-8試劑，于酶標(biāo)儀波長450?nm處檢測各組細(xì)胞OD值。

2.3 ?Western blot檢測阻斷劑靶向蛋白JAK2、IKKβ和成纖維細(xì)胞標(biāo)記分子α-平滑肌肌動蛋白、成纖維細(xì)胞活化蛋白及通路蛋白STAT3、p65表達(dá)水平

提取各組細(xì)胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。各組取10?μL蛋白上樣，經(jīng)5%、12%凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，置于4?℃冰箱與相應(yīng)的一抗（1∶1000）相結(jié)合，搖床過夜;次日與辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶4000）結(jié)合反應(yīng)，ECL發(fā)光顯色后，凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測，采用ImageJ軟件對圖像進(jìn)行灰度分析。以GAPDH作內(nèi)參照，計算各組蛋白的相對表達(dá)量。

3 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以x（—）±s表示。組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 ?結(jié)果

4.1??不同濃度阻斷劑AG490和BMS345541對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

與空白組比較，不同濃度AG490對BMSCs增殖無明顯影響（P>0.05），5、2.5?μmol/L?BMS345541對BMSCs增殖無明顯影響（P>0.05），而10?μmol/L?BMS345541干預(yù)后BMSCs的OD值明顯下降（P<0.05）。見圖1。

與空白組比較，模型組BMSCs增殖水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，10?μmol/L?AG490和5?μmol/L?BMS345541可使BMSCs增殖水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。因此，選擇10?μmol/L?AG490和5?μmol/L?BMS345541為用于本實驗的最佳作用濃度。

4.2??不同濃度阻斷劑對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向蛋白JAK2和IKKβ表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組BMSCs?JAK2和IKKβ表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，不同濃度阻斷劑干預(yù)后JAK2和IKKβ蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且與其濃度呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果見圖3～圖5。

4.3 ?細(xì)胞形態(tài)變化

通路阻斷劑干預(yù)后，空白組BMSCs細(xì)胞為梭形，排列整齊，呈旋渦狀生長;模型組BMSCs細(xì)胞排列紊亂、成團(tuán)簇狀生長;M+A組、M+B組和M+APS組細(xì)胞成纖維樣，排列分布較均勻。見圖6。

4.4 ?不同濃度阻斷劑對腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞標(biāo)記分子α-平滑肌肌動蛋白、成纖維細(xì)胞活化蛋白表達(dá)的影響

通路阻斷劑干預(yù)后，與空白組比較，模型組BMSCs TAFs標(biāo)記分子α-SMA和FAP蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，通路阻斷劑AG490、BMS345541及APS干預(yù)后，BMSCs?α-SMA和FAP蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。見圖7～圖9。

4.5 ?不同濃度阻斷劑對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通路關(guān)鍵蛋白STAT3和p65表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組BMSCs IL-6/STAT3通路關(guān)鍵蛋白STAT3和TNF-α/NF-κB通路關(guān)鍵蛋白p65表達(dá)明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，通路阻斷劑AG490、BMS345541及APS干預(yù)后，BMSCs IL-6/STAT3通路關(guān)鍵蛋白STAT3和TNF-α/NF-κB通路關(guān)鍵蛋白p65表達(dá)明顯降低（P<0.05）。見圖10～圖12。

5 ?討論

基于具有多向分化性及低免疫源性等優(yōu)點，BMSCs作為治療腫瘤的生物靶向載體已成為研究熱點，但在異常微環(huán)境中，BMSCs具有惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險，具體機(jī)制尚不明^[8]。本課題組前期實驗顯示，干細(xì)胞生存的微環(huán)境及信號通路的改變可誘導(dǎo)BMSCs向TAFs分化^[9]，這提示BMSCs在一定的炎性或腫瘤微環(huán)境中難以保全其自身的穩(wěn)定，可能具有了促瘤或致瘤性^[10]。腫瘤間質(zhì)中活化的成纖維細(xì)胞被稱作TAFs，又稱癌相關(guān)成纖維細(xì)胞，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，而BMSCs是TAFs的主要來源之一^[11-13]，因此在炎性或腫瘤微環(huán)境中，阻斷BMSCs向TAFs方向分化的路徑是維護(hù)BMSCs自身穩(wěn)定性的有效手段，也可能是BMSCs作為靶向載體發(fā)揮治療腫瘤作用的關(guān)鍵點之所在。劉永琦等^[14]基于中醫(yī)學(xué)“腎藏精，主骨生髓”理論，認(rèn)為構(gòu)成生命原始物質(zhì)的“先天之精”具有繁衍生殖、生髓化血、化氣化神等多元化生性，與BMSCs多向分化的能力具有對應(yīng)性，故認(rèn)為干細(xì)胞具有先天之精屬性，是先天之精在細(xì)胞層次的存在形式，BMSCs的分布與“元?dú)狻狈植家蚕嗨?sup>[15]。元精、元?dú)饨愿谀I，元精在元?dú)馔苿酉?，不斷濡養(yǎng)形體、臟腑、氣血，使五液充，五氣治，形體健，營衛(wèi)調(diào)，十二臟化源充足，BMSCs才能維持其自身的穩(wěn)定性。而在精傷氣耗所致腫瘤微環(huán)境中，精無所化而失潤，氣不衛(wèi)外而失固，十二臟生化無源，導(dǎo)致機(jī)體陰陽失衡，進(jìn)而使細(xì)胞信息傳導(dǎo)失司，最終BMSCs因內(nèi)外陰陽的失衡而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變。黃芪作為益氣之品，其性溫可助陽扶正以御外邪，其味甘可培補(bǔ)中氣使驅(qū)邪之力生化有源，其歸經(jīng)肺脾可益氣固表達(dá)“陰之使也”守護(hù)之功，諸用共奏平衡內(nèi)外陰陽之效。APS為黃芪的主要成分之一，有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗炎、抗病毒及抗氧化等藥理作用^[16]。

有研究表明，抑制IL-6/STAT3信號通路可減少TAFs介導(dǎo)的細(xì)胞增殖^[17]。當(dāng)NF-κB通路處于抑制狀態(tài)時，TAFs支持腫瘤促血管生成、癌細(xì)胞增殖、侵襲等作用被減弱^[18]。IKKβ亞基是調(diào)節(jié)NF-κB活性的主要上游靶點，而BMS345541是IKKβ的高選擇性抑制劑。本實驗結(jié)果顯示，10?μmol/L AG490、5?μmol/L BMS345541不僅能發(fā)揮明顯的阻斷作用并對BMSCs的增殖影響最小，且對各自所對應(yīng)靶蛋白抑制作用最明顯。通路阻斷劑干預(yù)后，兩通路中關(guān)鍵蛋白STAT3、p65表達(dá)均下降，TAFs標(biāo)記分子α-SMA、FAP蛋白表達(dá)也明顯減少。提示BMCSs向TAFs方向的分化與IL-6介導(dǎo)的STAT3通路和TNF-α介導(dǎo)的NF-κB通路有關(guān)，并且APS對異常微環(huán)境中的BMSCs發(fā)揮保護(hù)作用可能是通過調(diào)控IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路來實現(xiàn)的。

本實驗是用IL-6和TNF-α模擬炎性細(xì)胞微環(huán)境，主要從IL-6和TNF-α介導(dǎo)的經(jīng)典通路分析BMSCs炎性微環(huán)境異常分化機(jī)制。但炎性微環(huán)境極其復(fù)雜，對BMSCs的調(diào)控可能涉及多條通路、多種因子等的綜合作用。APS發(fā)揮作用的具體物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，有待深入研究和探索。

參考文獻(xiàn)：

[1] CHEN W， ZHENG R， BAADE P D， et al. Cancer statistics in China， 2015[J]. CA：A?cancer Journal for Clinicians，2016，66（2）：115-132.

[2] 劉永琦，王倩，秦潔，等.腫瘤微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、生長及增殖的影響[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2013，35（2）：180-187.

[3] QUANTE M， TU S P， TOMITA H， et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth[J]. Cancer Cell，2011，19（2）：257-272.

[4]?CHENG J， DENG Y， YI H， et al. Hepatic carcinoma-associated fibroblasts induce IDO-producing regulatory dendritic cells through IL-6-mediated STAT3 activation[J]. Oncogenesis，2016， 5（2）：e198.

[5]?KATANOY C， LERRER S， LIUBOMIRSKI Y， et al. Regulation of the inflammatory profile of stromal cells in human breast cancer： prominent roles for TNF-α and the NF-κB?pathway[J]. Stem Cell Research & Therapy，2015，6（1）：1.

[6] 晏軍，曹殊.腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用[J].腫瘤預(yù)防與治療，2014，27（6）：289-292.

[7] 武有明，張齊，劉永琦，等.黃芪多糖對肺癌微環(huán)境中BMSCs增殖及TAFs分化的影響[J].中藥藥理與臨床，2015，31（6）：76-79.

[8]?JAVAZON E H， BEGGSK J，?FLAKE A W. Mesenchymal stem cells： paradoxes of passaging[J].?Exp Hematol，2004，32：414-425.

[9]?ZHANG Y M， ZHANG Z M， GUAN Q L， et al. Co-culture with lung cancer A549 cells promotes the proliferation and migration of mesenchymal stem cells derived from bone marrow[J]. Experimental and Therapeutic Medicine，2017，14（4）：2983-2991.

[10] 張艷輝，劉永琦，駱亞莉，等.從陰陽平衡角度探討炎性信號通路失衡對間充質(zhì)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2017，28（12）：2967-2969.

[11]?LAWRENSON K，?GRUN B， LEE N，?et al. NPPB is a novel candidate biomarker expressed by cancer-associated fibroblasts in epithelial ovarian cancer[J]. Int J Cancer，2015，136（6）：1390-1401.

[12] ALSPACH E， FU Y， STEWART S?A. Senescence and the pro-tumorigenic stroma[J]. Crit Rev Oncog，2013，18（6）：549-558.

[13] PENF Y， LI Z， YANG P， et al. Direct contacts with colon cancer cells regulate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into tumor associated fibroblasts[J]. Biochem Biophys Res Commun，2014，451（1）：68-73.

[14] 劉永琦，張齊，李靜雅，等.熟地超濾膜提取物對氯化鎘誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及遺傳穩(wěn)定性變化的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2015，35（4）：450-456.

[15] 趙春華，趙洋洋，韓欽，等.從亞全能干細(xì)胞角度解讀遠(yuǎn)古醫(yī)學(xué)[J].醫(yī)學(xué)爭鳴，2013，4（2）：1-5.

[16] 曹琦，陳若文，孫桂菊，等.黃芪多糖生理功能研究進(jìn)展[J].糧食與食品工業(yè)，2016，23（2）：57-60.

[17]?SUBRAMANIAM K S，?OMAR I S， KWONG S C， et al. Cancer-associated fibroblasts promote endometrial cancer growth via activation of interleukin-6/STAT-3/c-Myc pathway[J]. American Journal of Cancer Research，2016，6（2）：200.

[18] BERDIEL-ACER M， SANZ-PAMPLONA R， CALON A， et al. Differences between CAFs and their paired NCF from adjacent colonic mucosa reveal functional heterogeneity of CAFs，?providing prognostic information[J]. Mol Oncol，2014，8（7）：1290-1305.