雙峰駝血清IgG純化及其抗血清制備

賈存瑜，韓熙夢(mèng)，聶佳琪，張 欣，焦韻潔， 劉寶元，周恩民，穆 楊

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)陜西科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，陜西楊凌 712100)

免疫球蛋白G(IgG)是機(jī)體血清中的主要抗體成分，約占血清抗體的75%，是體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮抗感染免疫的主要活性物質(zhì)。駱駝血清中有3種類(lèi)型的 IgG，分別為 IgG1、 IgG2 和 IgG3，其中 IgG1 為傳統(tǒng)抗體，IgG2 和 IgG3 為重鏈抗體(Heavy-chain only antibodies, HcAbs)，在駱駝科動(dòng)物中占IgG 總量的45%～75%[1-3]。與傳統(tǒng)的IgG1型抗體不同，重鏈抗體是一類(lèi)缺失輕鏈和重鏈第一個(gè)恒定區(qū)(CH1)的新型抗體，這種缺失輕鏈的重鏈抗體可變區(qū)(Variable domains of Camellidae heavy chain-only antibodies, VHH)晶體結(jié)構(gòu)呈橢圓形，長(zhǎng) 4 nm，直徑2.5 nm，分子質(zhì)量約15 ku，因此又被稱(chēng)為納米抗體(Nanobody, Nb)。Nb是目前已知最小的具有完整抗原結(jié)合功能的抗體片段[4-5]。相比于常規(guī)抗體的抗原結(jié)合區(qū)，納米抗體的單結(jié)構(gòu)域性質(zhì)具有獨(dú)特的特征，除了容易從體內(nèi)成熟文庫(kù)中克隆和選擇高親和力結(jié)合物的優(yōu)點(diǎn)外，納米抗體還具有其他技術(shù)、功能和生物物理學(xué)優(yōu)勢(shì)，如高表達(dá)產(chǎn)率和易于純化、高度可溶且穩(wěn)定、識(shí)別獨(dú)特的構(gòu)象表位等。納米抗體具有較高的特異性，而且由于納米抗體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，更便于被基因工程改造、重組表達(dá)和生產(chǎn)等[6-7]。目前已報(bào)道獲得多種抗原的納米抗體，抗原從小分子(如半抗原和肽)到大抗原(如蛋白質(zhì)或病毒)都有[8]。制備納米抗體常用的方法為噬菌體展示技術(shù)，用抗原免疫雙峰駝，收集雙峰駝血清，檢測(cè)抗體效價(jià)水平達(dá)到要求后分離免疫駱駝外周血淋巴細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，經(jīng)2輪PCR擴(kuò)增獲得編碼VHH的基因，連接噬菌體展示載體，經(jīng)電轉(zhuǎn)化等過(guò)程構(gòu)建噬菌體抗體文庫(kù)；然后利用抗原反復(fù)從文庫(kù)中淘選，獲得表達(dá)針對(duì)目的抗原納米抗體的重組噬菌體，用重組噬菌體感染合適的感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)納米抗體，進(jìn)行一系列鑒定后可以采用不同的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行納米抗體的大量表達(dá)。

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院重大動(dòng)物疫病病原感染和致病機(jī)制研究團(tuán)隊(duì)(本團(tuán)隊(duì))前期表達(dá)純化PCV2 Cap蛋白并進(jìn)行雙峰駝免疫，采集駱駝血清，為構(gòu)建多樣性廣泛的Cap蛋白納米抗體文庫(kù)，需對(duì)免疫后駱駝血清中抗Cap蛋白的抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)；目前已獲得針對(duì)不同病毒蛋白的多種納米抗體，后期需要對(duì)這些納米抗體進(jìn)行鑒定。然而，市場(chǎng)上目前尚無(wú)商品化的抗駱駝IgG的抗體。本研究通過(guò)純化駱駝血清IgG，并用純化的駱駝IgG免疫家兔，制備兔抗駱駝抗血清，為免疫血清效價(jià)檢測(cè)及納米抗體檢測(cè)提供材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性阿拉善雙峰駝購(gòu)自甘肅民勤駱駝養(yǎng)殖場(chǎng)，寄養(yǎng)于該廠，觀察 1 周后采血制備血清；雄性家兔 2 只，購(gòu)自楊凌周邊農(nóng)戶，飼養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院，觀察 1 周后進(jìn)行免疫。

1.1.2 主要試劑 Protein G 純化介質(zhì)購(gòu)自金斯瑞生物科技有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為Jackson Immuno Research公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)Marker為T(mén)hermo-Fisher公司產(chǎn)品；純化的PCV2 Cap蛋白、原核表達(dá)的豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)核蛋白納米抗體(SIV-Nb1)、連接穿膜肽TAT的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)Nsp9納米抗體(PRRSV-TAT-Nb6)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)N蛋白納米抗體(PEDV-Nb2)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)S蛋白納米抗體(TGEV-Nb15)由本團(tuán)隊(duì)制備并保存；PCV2 Cap蛋白單克隆抗體1E7由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所蔡雪輝研究員饋贈(zèng)，96 孔酶標(biāo)板為NUNC 公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 駱駝血清樣本制備 頸靜脈采集成年雄性阿拉善雙峰駝血液于50 mL無(wú)菌離心管，放置呈斜面，待血液凝固后將離心管置于37 ℃恒溫箱中30 min，再4 ℃放置過(guò)夜。用槍頭將血凝塊從管壁上撥落，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，收集血清分裝保存，備用。

1.2.2 駱駝血清IgG 的純化與鑒定 取5 mL血清與0.01 mol/L pH 7.2的磷酸緩沖鹽液(PBS) 按體積比1∶1混勻，用0.45 μm濾膜過(guò)濾得待純化樣品。用Protein G 親和樹(shù)脂純化駱駝血清IgG，純化前先用10倍柱體積的PBS平衡柱子至流出液A280≤0.01，將10 mL待純化樣品緩慢上柱，保持流速為0.5 mL/min，重復(fù)上樣8～10次，然后用 30 mL PBS洗滌樹(shù)脂，流速控制在 1 mL/min，至流出液 A280穩(wěn)定為止；用5倍柱體積的Elution buffer(0.1 mol/L pH 2.7甘氨酸溶液)洗脫IgG，流速控制在0.5 mL/min，每管收集洗脫液0.5 mL，并迅速加入50 μL 1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)中和pH至7.2～7.4。用超微量分光光度計(jì)測(cè)定每管洗脫液中 IgG的質(zhì)量濃度，將質(zhì)量濃度大于 0.5 mg/mL 的樣品合并，用 PBS 透析過(guò)夜后分裝，-20 ℃保存。留取少量樣品用 SDS-PAGE 分析蛋白純度。

1.2.3 純化的駱駝IgG純度分析 配制12%分離膠和5%濃縮膠并組裝電泳裝置，取適量收集的樣品加入2×SDS-PAGE loading buffer混勻后沸水浴10 min，10 000 r/min 離心1 min，取10 μL 加入蛋白膠孔，電壓100 V電泳約15 min后，調(diào)電壓至200 V繼續(xù)電泳，至溴酚藍(lán)電泳至凝膠下邊緣停止。小心取出凝膠，考馬斯亮藍(lán)染液染色2 h，脫色后觀察IgG 純化效果，并拍照保存。

1.2.4 兔抗駱駝IgG抗血清制備 家兔免疫前耳緣靜脈采血2 mL左右，分離血清-20 ℃保存，用作陰性對(duì)照。取純化的駱駝IgG 1 mg與等體積弗氏佐劑充分乳化，每只家兔每次免疫1 mg駱駝IgG，脊柱兩側(cè)皮下分點(diǎn)注射，間隔 2 周免疫 1 次，首次免疫使用弗氏完全佐劑，之后使用弗氏不完全佐劑。第 3 次免疫1 周后，頸動(dòng)脈采集血液，分離血清，分裝保存。

1.2.5 兔抗駱駝IgG抗血清抗體效價(jià)檢測(cè) 采用間接 ELISA 方法檢測(cè)兔抗駱駝 IgG 抗血清的抗體效價(jià)，以免疫前家兔血清為陰性對(duì)照。將純化的駱駝 IgG 用 PBS 稀釋至4 μg/mL，取 96 孔酶標(biāo)板，每孔加入100 μL，4 ℃包被過(guò)夜。PBS’T(φ=0.05% Tween-20的PBS)洗板4次后每孔加入封閉液(50 g/L 脫脂奶粉的PBS’T溶液) 200 μL，室溫封閉2 h，PBS’T洗板4次，將分離的免疫兔血清用封閉液稀釋至1∶1 000后再依次倍比稀釋加入96孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度重復(fù)3孔，室溫孵育2 h，PBS’T洗板后每孔加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，每孔100 μL，室溫孵育2 h。洗板后，用TMB顯色液顯色15 min，3 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，用超微量分光光度計(jì)讀取每孔450 nm吸光度值(OD450)。以免疫血清OD450/陰性血清 OD450>2.1的最高血清稀釋倍數(shù)確定兔抗駱駝IgG抗血清的抗體效價(jià)。

1.3 抗血清的應(yīng)用

1.3.1 PCV2 Cap蛋白免疫駱駝血清抗體效價(jià)檢測(cè) 用純化的Cap 蛋白免疫雙峰駝，免疫前頸靜脈采集駱駝血液，分離血清作為陰性對(duì)照。每次免疫量為2 mg，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化，之后用弗氏不完全佐劑乳化；皮下分點(diǎn)注射免疫，每間隔2周免疫 1 次。免疫5 次后頸靜脈采集血液，分離血清，采用間接ELISA方法檢測(cè)免疫血清中抗Cap蛋白的抗體效價(jià)。將純化的Cap 蛋白用PBS稀釋至4 μg/mL，加入96 孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜。PBS’T洗板4次后每孔加入200 μL 封閉液室溫封閉2 h，免疫前和免疫后的駱駝血清分別進(jìn)行倍比稀釋后加入96 孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)，室溫反應(yīng)2 h，PBS’T洗滌4 次后每孔后加入1∶2 000 稀釋的兔抗駱駝IgG抗血清100 μL，室溫反應(yīng) 2 h，PBS’T洗滌4 次后每孔加入1∶5 000 稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 100 μL，室溫孵育2 h。洗板后，用TMB顯色液顯色15 min，3 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，用超微量分光光度計(jì)讀取每孔OD450。

1.3.2 納米抗體的Western blot檢測(cè) 將原核表達(dá)SIV-Nb1、PRRSV-TAT-Nb6、PEDV-Nb2、TGEV-Nb15和 PCV2 Cap蛋白單克隆抗體1E7進(jìn)行12% 分離膠的SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h后，以制備的兔抗駱駝血清IgG(1∶2 000稀釋)為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)為二抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)，確定制備的抗血清與針對(duì)不同病毒蛋白的納米抗體的反應(yīng)原性。

2 結(jié)果與分析

2.1 駱駝血清IgG 的純化

用Protein G 親和樹(shù)脂純化駱駝血清IgG，SDS-PAGE 檢測(cè)認(rèn)為駱駝IgG純度良好(圖1)。從圖1可以看出，用Protein G純化的駱駝 IgG 中存在2種類(lèi)型的重鏈，一種是傳統(tǒng)的分子質(zhì)量約 50 ku的重鏈，另一種是缺失CH1的分子質(zhì)量為 43 ku 左右的重鏈。在洗滌液中也可以隱約看到一條重鏈，是沒(méi)有和Protein G結(jié)合的IgG2型重鏈。超微量分光光度計(jì)測(cè)得純化的駱駝IgG質(zhì)量濃度為1 mg/mL，共獲得12 mg 純化的駱駝IgG，完全滿足后續(xù)家兔免疫和抗體效價(jià)檢測(cè)。

M. 蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn) Protein marker；1.PBS；2～4. 洗脫液 Elution buffer

圖1SDS-PAGE分析駱駝IgG純化效果
Fig.1AnalysisofpurifiedcamelIgGbySDS-PAGE

2.2 兔抗駱駝IgG抗血清效價(jià)檢測(cè)

利用間接ELISA方法，對(duì)免疫后的2 只免疫兔血清進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)(圖2)，從圖2可以看出，免疫前血清的OD450一直很低，隨著稀釋度的增大，OD450不斷降低，2只免疫兔血清在稀釋1 024 000倍時(shí)，OD450仍分別達(dá)0.206±0.009 9和0.264±0.030 2，與陰性對(duì)照血清OD450(0.129±0.002 1)比值均小于2.1，因此確定獲得的免疫兔血清中兔抗駱駝IgG抗體效價(jià)為1∶512 000[9]。

圖2 兔抗駱駝IgG 抗血清抗體效價(jià)檢測(cè)Fig.2 Antibody titer of rabbit anti-camel IgG immune sera

2.3 PCV2 Cap蛋白免疫駱駝血清抗Cap蛋白抗體效價(jià)檢測(cè)

用純化的Cap 蛋白免疫雙峰駝，第5次免疫1 周后采集血液分離血清，間接ELISA方法檢測(cè)免疫血清中抗Cap蛋白的抗體效價(jià)，結(jié)果如圖3所示。免疫前血清OD450小于0.115±0.004 1，免疫后血清4 000倍稀釋時(shí)OD450為1.977±0.094，隨著血清稀釋倍數(shù)的增大，OD450不斷降低；當(dāng)血清被稀釋1 024 000倍時(shí)，OD450為0.220±0.018，與陰性對(duì)照血清OD450(0.092±0.006)的比值為2.378，而血清被稀釋2 048 000倍時(shí)，OD450為0.130±0.004，與陰性對(duì)照血清OD450(0.072±0.012)的比值為1.802，說(shuō)明免疫5次后駱駝血清中抗Cap蛋白的抗體效價(jià)達(dá)1∶1 024 000[9]。

圖3 免疫駱駝血清中抗Cap蛋白抗體效價(jià)檢測(cè)Fig.3 Antibody titer of anti-Cap protein in serum of immune camel

2.4 納米抗體的檢測(cè)

以制備的兔抗駱駝IgG抗血清采用Western blot方法檢測(cè)本團(tuán)隊(duì)制備保存的原核表達(dá)的SIV-Nb1、PRRSV-TAT-Nb6、PEDV-Nb2、TGEV-Nb15和 PCV2 Cap蛋白單克隆抗體1E7。結(jié)果顯示，制備的抗血清可以與表達(dá)的納米抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，但與來(lái)源于小鼠腹水的PCV2 Cap蛋白單克隆抗體不反應(yīng)(圖4)。由于這些納米抗體的CDR3區(qū)氨基酸數(shù)目多少不一，因此顯示的印跡條帶大小稍有差異，但基本均在15 ku左右；本團(tuán)隊(duì)在PRRSV Nsp9的納米抗體上連接促進(jìn)其穿過(guò)細(xì)胞膜的穿膜肽TAT，所以檢測(cè)到的PRRSV-TAT-Nb6條帶比其他的納米抗體條帶稍大一些。結(jié)果說(shuō)明制備的兔抗駱駝IgG抗血清可以用于納米抗體的檢測(cè)。

圖4 納米抗體的Western blot檢測(cè)Fig.4 Detection of different nanobodies with Western blot method

3 討 論

1993年，Hamers-Casterman等[2]報(bào)道在駱駝科動(dòng)物(單峰駝、雙峰駝、美洲駝等)體內(nèi)不僅存在分子質(zhì)量約為 150 ku 的常規(guī)四聚體抗體 IgG1，還存在天然的重鏈抗體(Heavy chain antibodies，HcAbs)，包含IgG2和IgG3亞型；其中IgG1由2條重鏈和2條輕鏈構(gòu)成的，而HcAbs僅由2條不含第一個(gè)恒定區(qū)(CH1)的重鏈構(gòu)成。常規(guī)抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)是由重鏈和輕鏈的可變區(qū)形成，與傳統(tǒng)IgG的抗原結(jié)合位點(diǎn)相比，駱駝重鏈抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)僅由一個(gè)單獨(dú)的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，即重鏈抗體可變區(qū)(Variable domain of the heavy chain of HCAb,VHH)[10]。納米抗體較普通抗體具有一些獨(dú)特性能，如分子質(zhì)量小、親和力高、穩(wěn)定性高、水溶性好、免疫原性弱、抗原結(jié)合力廣泛且良好等[11]。納米抗體的尺寸很小，使其成為體內(nèi)功能性干擾研究的便利工具[12]。由于其獨(dú)特的性質(zhì)，納米抗體在未來(lái)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中有取代常規(guī)抗體[13]的潛力。

目前，納米抗體作為一種新型小分子抗體已成為生物科技領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在人醫(yī)上，納米抗體在科學(xué)研究、腫瘤等疾病檢測(cè)與治療、疫苗研發(fā)、霉菌毒素檢測(cè)等方面均取得顯著的成果[14-18]。在獸醫(yī)方面，有關(guān)納米抗體的研究也越來(lái)越多[19-21]。筆者團(tuán)隊(duì)的劉紅亮博士利用噬菌體展示技術(shù)分別篩選到豬繁殖與呼吸綜合征病毒 Nsp9及Nsp4蛋白的納米抗體，并在HEK293T 細(xì)胞進(jìn)行Nsp9納米抗體Nb6的穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)的 Nb6 可以結(jié)合PRRSV 編碼的Nsp9蛋白，并抑制病毒基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，有望開(kāi)發(fā)成為新型的抗PRRSV藥物[22-23]。

常用的納米抗體制備方法為噬菌體展示技術(shù)，即以免疫駱駝淋巴細(xì)胞基因組為模板擴(kuò)增表達(dá)VHH的基因片段，將序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使VHH基因隨噬菌體外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，VHH隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面[24]。為構(gòu)建多樣性廣泛的噬菌體納米抗體文庫(kù)，駱駝免疫后需要檢測(cè)免疫駱駝血清中針對(duì)目的蛋白的抗體水平，篩選完成后也需要對(duì)表達(dá)的納米抗體進(jìn)行特異性與效價(jià)檢測(cè)。然而，市場(chǎng)上目前尚缺少商品化的抗駱駝IgG的抗體。本研究收集駱駝血清，利用Protein G親和樹(shù)脂純化駱駝IgG，經(jīng)SDS-PAGE分析，純化的駱駝 IgG 中存在2種類(lèi)型的重鏈，一種是傳統(tǒng)的分子質(zhì)量約 50 ku的重鏈，另一種是缺失CH1的 43 ku 左右的重鏈，SDS-PAGE顯示沒(méi)有約46 ku的IgG2型重鏈，因?yàn)镮gG1和IgG3結(jié)合Protein G和Protein A，而IgG2只結(jié)合Protein A[2,25-26]，如果要收集IgG2，只要用Protein G的流穿液(Flow-through)再過(guò)Protein A樹(shù)脂進(jìn)行純化即可。用純化的駱駝IgG 免疫家兔，分離免疫兔血清，采用間接ELISA方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示兔抗駱駝IgG抗血清抗體效價(jià)超過(guò)1∶512 000，利用制備的兔抗駱駝IgG抗血清檢測(cè)PCV2 Cap蛋白免疫后駱駝的抗體水平，顯示5次免疫后駱駝血清中抗Cap蛋白的抗體效價(jià)達(dá)到1∶1 024 000以上，說(shuō)明制備的兔抗駱駝IgG抗血清能用于后續(xù)納米抗體制備中的ELISA檢測(cè)。用制備的抗血清采用Western blot方法檢測(cè)本團(tuán)隊(duì)制備保存的針對(duì)不同病毒蛋白的納米抗體SIV-Nb1、PRRSV-TAT-Nb6、PEDV-Nb2、TGEV-Nb15和 PCV2 Cap蛋白單克隆抗體1E7，發(fā)現(xiàn)制備的抗血清可以和納米抗體反應(yīng)而不與來(lái)源于小鼠腹水的單克隆抗體反應(yīng)，說(shuō)明制備的兔抗駱駝IgG抗血清可以用于后續(xù)表達(dá)的納米抗體的檢測(cè)。本研究結(jié)果為目標(biāo)蛋白免疫駱駝后抗體效價(jià)檢測(cè)提供關(guān)鍵的材料，也為表達(dá)的納米抗體的檢測(cè)提供材料。