藤椒冷榨油餅粕中多酚的純化及體外抗氧化活性

徐丹萍，蒲 彪 ，葉 萌，王春霞，付本寧，蔡沁玥，文秋萍

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川雅安 625014；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，成都 611130)

花椒是蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL.)植物?；ń饭欧Q椒、秦椒、大椒、椒聊、鳳椒、丹椒等，是中國原產(chǎn)的一種具有濃郁辛香的落葉灌木或小喬木樹種，常作為調(diào)味品、香料、入藥、木本油料[1]。藤椒學(xué)名叫竹葉花椒(Zanthoxylumarmatum)，是青花椒的一種，在中國遼寧以南、五嶺以北大多數(shù)省區(qū)均有栽培[2]。藤椒果皮榨油的方法主要有有機(jī)溶劑浸提法、傳統(tǒng)機(jī)械壓榨法，這2種方法均會對營養(yǎng)物質(zhì)造成一定破壞，限制油脂的品質(zhì)。冷榨制油技術(shù)是在室溫至65 ℃溫度下經(jīng)榨油機(jī)壓榨獲得油脂和餅粕的方法，獲得的油脂品質(zhì)好、純度高、得率大、營養(yǎng)成分豐富，相對于傳統(tǒng)方法具有自己獨(dú)特的優(yōu)勢[3]。冷榨法得到的餅粕中同樣含有蛋白質(zhì)、油脂、多糖、礦質(zhì)元素、抗氧化生物活性物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，可用作食品添加劑[4]；在工業(yè)上可用于制造生物柴油、潤滑油、涂料、增塑劑等[5-6]。目前，國內(nèi)冷榨油餅粕主要用于動物飼料或作物肥料，其營養(yǎng)價值未被充分開發(fā)利用，造成極大的浪費(fèi)。多酚類化合物是植物次級代謝產(chǎn)物之一，具有多種生理活性，素有“第七營養(yǎng)素”之稱，具有抑菌、抗突變、抗腫瘤、抗病毒、降血糖降血脂、防輻射、清除自由基及抗衰老等作用，是重要的生物活性成分[7-8]。本研究主要對藤椒果皮冷榨油餅粕中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取和純化，并優(yōu)化提取和純化條件，檢測提取物的抗氧化活性，為花椒資源的有效利用和冷榨油餅粕的進(jìn)一步開發(fā)提供一定數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤椒(Zanthoxylumarmatum)干果皮(以下簡稱藤椒)及藤椒冷榨油餅粕(以下簡稱餅粕)由洪雅幺麻子藤椒油食品有限公司提供。

沒食子酸、無水乙醇、碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、鄰苯三酚、石油醚(沸程40～60 ℃)等均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，純度≥98.00%美國Sigma 公司；樹脂HPD600、AB-8、D-101河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微波科學(xué)實(shí)驗爐ORW08S-3H，南京澳潤微波科技有限公司；臺式真空干燥箱DZF-6050-T，上海丙林電子科技有限公司；離心機(jī)Thermo MULTIFUGE X3，美國Thermo公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE 52-99，上海亞榮生化儀器廠；全波長酶標(biāo)儀Varioskan flash，美國Thermo公司；16 mm×200 mm層析柱，成都麥德生科技有限公司；電子天平CP225D，德國Sartorius股份公司；自動部分收集器BSZ-100，上海滬西分析儀器廠有限公司；氣浴恒溫振蕩器ZD-85，金壇市科析儀器有限公司；紫外-可見分光光度計UV-3100型，上海美普達(dá)儀器有限公司；超聲波清洗器AS10200A，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 多酚得率測定 按照福林酚法測定多酚質(zhì)量濃度[9]。用乙醇將沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL系列梯度的沒食子酸工作液，吸取不同質(zhì)量濃度的沒食子酸工作液1.00 mL分別與5.00 mL福林酚試劑混合，搖勻，反應(yīng)5 min，加入4.00 mLω=7.50%的Na2CO3溶液，室溫反應(yīng)60 min。測定混合液在765 nm下吸光度值。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將餅粕在45 ℃條件下真空干燥，粉碎至60目，用石油醚索氏提取，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后獲得脫脂餅粕粉。取一定量脫脂餅粕粉，按一定條件進(jìn)行提取，提取液用乙醇定容，獲得一定濃度的樣品液。按照福林酚法以1.00 mL樣品液替代沒食子酸工作液測定多酚質(zhì)量濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品液中多酚質(zhì)量濃度，并按式(1)計算多酚得率(以沒食子酸計)。

多酚得率=C×V/M

(1)

式中，C為樣品液中多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為樣品液體積(mL)；M為脫脂粉質(zhì)量(g)。

1.3.2 多酚提取工藝條件優(yōu)化 單因素試驗：以乙醇為溶劑，采用微波輔助提取法提取脫脂餅粕粉中的多酚并進(jìn)行工藝優(yōu)化。單因素試驗以餅粕多酚得率為指標(biāo)，分別考察料液比[質(zhì)量(g)∶體積(mL)]為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40]，微波功率(200、300、400、500、600、700、800 W)，微波處理時間(60、120、180、240、300、360、420 s)，提取溫度(25、30、40、50、60、70、80 ℃)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)5個影響提取效果的關(guān)鍵因素對餅粕中多酚得率的影響[10]?？疾炷骋粏我蛩貢r，僅改變該單因素條件，其他因素條件固定，各固定因素的條件分別為：料液比1∶25，微波功率500 W，微波處理時間240 s，提取溫度50 ℃，乙醇φ=70%。

正交試驗設(shè)計：通過單因素試驗選擇各因素較優(yōu)的4個水平，通過正交試驗進(jìn)一步確定較優(yōu)的提取工藝條件。采用五因素四水平L16(45)正交設(shè)計試驗，考察料液比(A)、微波處理時間(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、微波功率(D)、提取溫度(E)對藤椒冷榨油餅粕多酚得率的影響，確定最佳提取工藝條件。正交試驗設(shè)計因素水平如表1。在最佳工藝條件下進(jìn)行驗證試驗，獲得餅粕多酚在最優(yōu)提取條件下的得率。每個水平進(jìn)行3次平行試驗。

表1 餅粕多酚提取正交試驗設(shè)計因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment design for polyphenol extraction

按照餅粕多酚的最佳提取工藝條件提取藤椒多酚，根據(jù)“1.3.1”測定多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，按式(1)計算藤椒多酚得率。

1.3.3 多酚純化工藝條件優(yōu)化 多酚的純化方法：采用乙醇沉淀法對去除多酚提取液中蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，利用大孔樹脂進(jìn)一步純化，并優(yōu)化大孔樹脂純化條件[11]。據(jù)報道，極性樹脂HPD600、弱極性樹脂AB-8、非極性樹脂D-101均對多酚具有一定純化效果[12-14]。

大孔樹脂優(yōu)選：選擇極性樹脂HPD600、弱極性樹脂AB-8、非極性樹脂D-101對多酚進(jìn)行吸附純化。利用經(jīng)“1.3.2”優(yōu)化得到的條件提取多酚得到多酚粗提液，粗提液經(jīng)減壓濃縮至一定體積，加入乙醇至φ=80%，靜置2 h后離心取上清液，重復(fù)操作3次。上清液減壓濃縮后冷凍干燥，用無水乙醇將凍干物配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL 的多酚溶液。

分別精密稱取預(yù)處理好的3種大孔樹脂1.00 g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，加入1.00 mg/mL多酚溶液50.00 mL，25 ℃恒溫振搖吸附6 h，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多酚質(zhì)量濃度。吸附后的大孔樹脂用蒸餾水清洗2～3次，加入φ=80%乙醇50.00 mL，25 ℃恒溫振搖解吸6 h，取解析液測定多酚質(zhì)量濃度，按下式計算樹脂的吸附量、吸附率、解吸率、回收率。

吸附量=(C0-C1)/M×V1

(2)

吸附率=(C0-C1)/C0×100%

(3)

解吸率=(C2×V2/(C0-C1)×V1×100%

(4)

回收率=(C2×V2)/(C0×V1)×100%

(5)

式中，C0為起始多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)；C1為平衡多酚的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V1為吸附液體積(mL)；M為樹脂干質(zhì)量(g)；C2為解吸液質(zhì)量濃度(mg/mL)；V2為解吸液體積(mL)。

樹脂靜態(tài)吸附-解析條件優(yōu)化：上樣液pH對靜態(tài)吸附的影響。優(yōu)選的大孔樹脂預(yù)處理后取1.00 g于250 mL具塞錐形瓶中，加入pH分別為2、3、4、5、6、7、8，質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的餅粕多酚樣液50.00 mL，密封，25 ℃恒溫振搖吸附6 h，取上清液測定多酚質(zhì)量濃度，計算吸附率，確定上樣液最優(yōu)pH。

上樣液濃度對樹脂靜態(tài)吸附的影響。精密稱取優(yōu)選并預(yù)處理好的大孔樹脂1.00 g于250 mL具塞錐形瓶中，加入前面確定的上樣液最優(yōu)pH，質(zhì)量濃度為0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg/mL的餅粕多酚溶液50.00 mL，密封，25 ℃恒溫振搖吸附6 h，取上清液測定多酚質(zhì)量濃度，計算吸附率，分析樣品上樣質(zhì)量濃度對大孔樹脂吸附餅粕多酚的影響。

解析液乙醇濃度對樹脂靜態(tài)解吸的影響。精密稱取優(yōu)選并預(yù)處理好的大孔樹脂1.00 g于250 mL具塞錐形瓶中，加入前面確定的上樣液最優(yōu)pH，和確定的最優(yōu)濃度的餅粕多酚溶液50.00 mL，密封，25 ℃恒溫振搖吸附6 h，過濾，樹脂用蒸餾水清洗2～3次，加入體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、95%乙醇50.00 mL，25 ℃恒溫振搖解吸6 h，取樣測定多酚質(zhì)量濃度，計算解吸率，分析洗脫液濃度對大孔樹脂解吸餅粕多酚的影響。

樹脂動態(tài)吸附-解吸條件優(yōu)化：上樣溶液流速對吸附的影響。選用16 mm×200 mm層析柱，稱取5.00 g 優(yōu)選的大孔樹脂，濕法上柱，200 mL蒸餾水沖柱。確定的最優(yōu)pH、上樣液體積分?jǐn)?shù)條件下，控制上樣流速分別為0.50、1.00、1.50、2.00 mL/min。檢測流出液多酚質(zhì)量濃度，分析上樣溶液流速對大孔樹脂吸附餅粕多酚的影響。

洗脫液流速對洗脫的影響。樣品溶液按上述確定的條件上樣，吸附平衡1 h后，在確定的乙醇最優(yōu)濃度條件下，控制洗脫流速分別為0.50、0.75、1.00、1.25 mL/min進(jìn)行洗脫檢測流出液中多酚質(zhì)量濃度，分析洗脫液流速對洗脫的影響。

餅粕多酚和藤椒多酚的純化：按照優(yōu)化的多酚純化工藝條件，對餅粕多酚和藤椒多酚分別進(jìn)行純化，洗脫液經(jīng)減壓濃縮冷凍干燥，取適量純化物配制為溶液，采用福林酚法測定多酚的質(zhì)量濃度，按式(6)計算多酚純度。

多酚純度/%=C×V/M×100

(6)

式中，C為樣液多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為樣液體積(mL)；M為多酚純化物質(zhì)量(mg)。

1.3.4 多酚體外抗氧化活性測定 樣品溶液制備：將餅粕多酚和藤椒多酚純化物分別按倍比稀釋法配制成一系列梯度濃度溶液，做體外抗氧化活性分析。同時配制一定濃度梯度的BHT溶液做陽性對照。

總還原能力的測定：采用鐵氰化鉀法[15]。分別取一系列濃度梯度的樣液2.50 mL，加入2.50 mL 0.20 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 6.6)和2.50 mLω=5%鐵氰化鉀溶液，混勻，在50 ℃條件下保溫20 min，再加入2.50 mLω=10.00%的三氯乙酸，充分混勻后，以3 000 r/min離心10 min。取上清液2.50 mL，加入0.50 mLω= 0.10%的三氯化鐵，并在700 nm波長處測吸光度(A)值。

D=[1-(Ax-Ax0)/(A0-A00)]×100%

(7)

ABTS+·的清除：參照羅少宏[17]的方法，并作一定改進(jìn)。準(zhǔn)確量取1.00 mL不同濃度樣品溶液，分別加入10.00 mL ABTS離子液，充分混勻后避光反應(yīng)6 min，測定6 min后溶液在734 nm處的吸光度分別計作Ax；以樣品溶劑代替樣品溶液做對照，并記吸光度值為Ax0。以PBS(0.10 mol/L ，pH=7.4)代替ABTS離子液做空白，測試方法不變，計作A0。同時以BHT做對照。ABTS+·清除率(D)按式8計算。

D=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100%

(8)

DPPH·的清除：0.20 mL不同濃度樣品溶液與5.00 mL 0.10 mmol/L DPPH·無水乙醇溶液混合，于室溫下避光放置30 min，測定其在517 nm下的吸光度值(Ax)；以0.20 mL樣品溶劑代替樣品為空白對照(Ax0)；以0.20 mL樣品與5 .00 mL無水乙醇混合液為樣品本底吸收校正(A0)。DPPH·清除率(D)按式(8)計算[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚提取工藝條件優(yōu)化

由微波輔助提取工藝單因素試驗結(jié)果(圖1)可知，通過單因素試驗選取的5個因素的條件分別是料液比1∶25，微波處理時間300 s，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，微波功率600 W，提取溫度60 ℃。

圖1 微波處理工藝各因素對多酚提取效果影響Fig.1 Effect of different factors of microwave treatment on extraction of polyphenols

2.1.2 餅粕多酚微波輔助提取正交試驗結(jié)果 根據(jù)極差分析(表2)可知，在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，微波輔助提取餅粕多酚的各因素對得率影響的主次順序為A>D>B>E>C，即產(chǎn)生影響的最重要因素是料液比，其次是微波功率、微波處理時間、提取溫度，乙醇體積分?jǐn)?shù)對餅粕多酚得率的影響相對較小。從正交試驗方差分析結(jié)果(表3)可以看出，各因素對多酚得率的影響均極顯著，說明這5個因素對餅粕多酚得率均有較大影響。

通過正交試驗可以確定提取條件的優(yōu)化組合為A3B4C1D2E3，即料液比1∶25、微波處理360 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、微波功率400 W、提取溫度60 ℃，按照此條件進(jìn)行3次最佳提取工藝驗證試驗，分酚得率為(6.83±0.09) mg/g，優(yōu)于正交試驗中各個條件下的多酚得率，表明該工藝條件穩(wěn)定，利用該正交試驗優(yōu)化微波輔助提取餅粕多酚的工藝是可行的。同時，按上述工藝條件提取藤椒多酚，得率為(15.45±0.09) mg/g。

表2 正交試驗結(jié)果與極差分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

注：0.01

Note: * Significant at level of 0.01

2.2 多酚純化工藝條件優(yōu)化

2.2.1 大孔樹脂優(yōu)選 3種樹脂對餅粕多酚的純化效果見表4。大孔樹脂與待分離物質(zhì)的結(jié)合力強(qiáng)弱與基團(tuán)的極性有關(guān)。由表4可以看出，極性樹脂HPD600對多酚的吸附率最低，弱極性樹脂AB-8對多酚具有較好的吸附效果。就解吸率而言，樹脂D-101表現(xiàn)最佳，其次是樹脂AB-8。雖然樹脂AB-8的解吸率低于D-101，但是樹脂AB-8的吸附量、吸附率、回收率的值在3種樹脂中均最高。綜合各方面因素，本試驗選用樹脂AB-8進(jìn)行多酚吸附純化試驗。Yi等[13]采用AB-8樹脂對PinusKoraiensisPinecones中的多酚進(jìn)行純化，發(fā)現(xiàn)AB-8樹脂在2 h內(nèi)吸附和解吸速率增長最快，之后達(dá)到飽和，具有很好的吸附性和解吸性能。

表4 不同樹脂對餅粕多酚吸附效果的影響Table 4 Effect of different resins on adsorption of polyphenols

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05).

2.2.2 樹脂靜態(tài)吸附-解吸工藝的確定 由圖2中吸附率隨pH的變化趨勢可知，當(dāng)pH為4，即溶液呈酸性時，樹脂AB-8對餅粕多酚的吸附率最高。原因可能是餅粕多酚呈弱堿性，在酸性條件下較易被吸附，而在堿性環(huán)境下，多酚解離為離子狀態(tài)，不利于樹脂的吸附作用[18]。選擇pH為4作為多酚吸附的最佳pH。

由吸附率隨上樣液質(zhì)量濃度的變化趨勢可以看出，樹脂對多酚的吸附率隨著多酚上樣液濃度的增加呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)多酚質(zhì)量濃度較低時，多酚分子向樹脂內(nèi)部的擴(kuò)散較慢，吸附率低；隨著質(zhì)量濃度的增加，加速了多酚分子向樹脂內(nèi)部的擴(kuò)散，吸附率逐漸上升；當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，因樹脂的吸附量有限，多酚分子間、多酚與雜質(zhì)間競爭增加，吸附作用受到阻礙[19]。選上樣液質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL(上樣液多酚質(zhì)量濃度為0.53 mg/mL)。

從解析率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化趨勢得到，當(dāng)解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)小于60%時，解吸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而升高，主要原因是餅粕多酚隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，溶解量增大，同時增大了大孔樹脂的溶脹，使多酚更易被洗脫下來。乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時，增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，吸附在樹脂上的弱極性色素被一并洗下，影響產(chǎn)品純度，解吸率反而下降。因此，選擇60%作為解吸液乙醇的體積分?jǐn)?shù)。

圖2 不同條件對樹脂靜態(tài)吸附-解吸效果的影響Fig.2 Effect of different conditions on static adsorption and desorption of resin

2.2.3 樹脂動態(tài)吸附-解吸工藝的確定 樣液流速對吸附效果的影響及洗脫液流速對解析效果的影響如圖3。當(dāng)流出液中多酚的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)達(dá)到上樣液多酚質(zhì)量濃度的1/10時，被認(rèn)為已經(jīng)產(chǎn)生泄漏，稱為到達(dá)泄漏點(diǎn)[20]。而在動態(tài)吸附過程中，上樣液的流速直接影響著泄漏點(diǎn)的出現(xiàn)時間。圖3中，上樣溶液流速越低，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)需要的流出液體積越多，時間越長。但流速過小，操作時間長，效率低，流速過大，樣品純化效果降低。因此選擇1.00 mL/min作為上樣流速。

圖3 上樣液流速對動態(tài)吸附效果的影響Fig.3 Effect of sample solution flow rate on dynamic adsorption

洗脫液流速對解吸效果的影響如圖4。當(dāng)洗脫流速為1.25 mL/min時，洗脫帶較寬，且有明顯的拖尾現(xiàn)象，說明過快的洗脫速度不利于洗脫液與樹脂上的多酚的充分作用；當(dāng)洗脫流速為1.00、0.75 mL/min時，兩者洗脫峰較為相似，洗脫峰較集中，拖尾現(xiàn)象不明顯；當(dāng)洗脫流速為0.50 mL/min時，洗脫液能夠充分溶解被樹脂吸附的多酚，解吸峰集中、對稱，然而洗脫時間過長，影響效率。綜合上述分析，考慮選擇的流速1.00 mL/min作為多酚的最佳洗脫流速。

圖4 洗脫液流速對動態(tài)解吸效果的影響Fig.4 Effect of eluent flow rate on dynamic desorption

2.2.4 多酚的純化 綜合上述研究，采用AB-8弱極性樹脂對藤椒冷榨油餅粕中的多酚進(jìn)行純化，上樣液pH為4、上樣液質(zhì)量濃度為1.50 mg/mL(多酚實(shí)際質(zhì)量濃度0.53 mg/mL)，以1.00 mL/min流速上樣，上樣結(jié)束后吸附平衡1 h，用60%乙醇以1.00 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。經(jīng)過純化，餅粕多酚的純度由35.70%±2.87%提高到76.30%±3.28%。采用同樣的方法純化藤椒多酚，藤椒多酚的純度由29.52%±1.72%增加到70.20%±2.74%。

2.3 多酚體外抗氧化活性

2.3.1 多酚的還原力 物質(zhì)的還原能力與抗氧化活性之間存在十分密切的關(guān)系，還原力強(qiáng)，表示其具有強(qiáng)的抗氧化性[21]。在Fe3+- Fe2+氧化還原體系中，可通過顯色反應(yīng)來判斷還原程度，吸光度越大，還原能力越強(qiáng)。由圖5樣品質(zhì)量濃度變化對多酚還原力的影響曲線圖可以看出，在質(zhì)量濃度為0.05～0.50 mg/mL時，多酚提取物、BHT均在較低質(zhì)量濃度下有較高的還原力，且還原力均是隨質(zhì)量濃度的增大而增大。其中，BHT作為合成抗氧化劑常被用作天然提取物的體外抗氧化活性對比分析。在低質(zhì)量濃度(小于0.14 mg/mL)條件下，3種受試物的還原力大小依次：藤椒多酚>餅粕多酚>BHT，而隨著質(zhì)量濃度的增加，BHT的還原力變化幅度較其余兩者更大。

各受試物還原能力與其濃度的相關(guān)性分析見表5，各受試物的還原能力與其濃度的相關(guān)系數(shù)均大于0.9，表明在試驗濃度范圍內(nèi)存在量效關(guān)系。

圖5 樣品濃度變化對多酚還原力的影響Fig.5 Effect of sample concentration on reduction of polyphenol

樣品Sample回歸方程Regression equation相關(guān)系數(shù)Correlation coefficientBHTy=1.137 60 x+0.070 870.978 62餅粕多酚 Biscuit polyphenolsy=0.771 81 x+0.139 800.981 44藤椒多酚Zanthoxylum armatum polyphenolsy=0.854 91 x+0.147 400.995 98

注：回歸方程中“x”代表各受試物質(zhì)量濃度，“y”代表各受試物的還原能力。

Note: In the regression equation, “x” represents mass concentration of each test substance, and “y” represents reducing ability of each test substance.

圖6 樣品質(zhì)量濃度變化對多酚清除作用的影響Fig.6 Effect of sample mass concentration on removal of from polyphenols

2.3.3 多酚清除ABTS+·的能力 由圖7可見，隨多酚質(zhì)量濃度的增加，ABTS+·的清除率有一定變化：藤椒多酚和餅粕多酚對ABTS+·的清除能力增長趨勢基本相同，質(zhì)量濃度小于0.20 mg/mL 時，餅粕多酚和藤椒多酚對ABTS+·的清除率急劇增加，多酚質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，清除率基本趨于穩(wěn)定。BHT對ABTS+·的清除率隨多酚質(zhì)量濃度增加變化不明顯，質(zhì)量濃度高于0.40 mg/mL后，三者的清除率基本持平。總體來說，藤椒多酚對ABTS+· 的清除優(yōu)于餅粕多酚，兩者對ABTS+·的IC50值分別為：0.052、0.063 mg/mL，而BHT對ABTS+·清除效果最優(yōu)，IC50值低于0.005 mg/mL。

圖7 樣品質(zhì)量濃度變化對多酚清除ABTS·+作用的影響Fig.7 Effect of sample mass concentration on removal of ABTS·+ from polyphenols

2.3.4 多酚清除 DPPH·的能力 隨樣品中多酚質(zhì)量濃度增加對DPPH·清除率變化如圖8。由圖可知，在0.05～0.50 mg/mL范圍內(nèi)，樣品溶液對DPPH·的清除率隨質(zhì)量濃度的增加逐漸升高，質(zhì)量濃度大于0.4 0 mg/mL時，對DPPH·的清除率達(dá)到90.00%以上。餅粕多酚IC50值為0.126 mg/mL，藤椒多酚IC50值為0.090 mg/mL，而BHT的IC50值則為0.054 mg/mL。在同樣的提取條件下，餅粕多酚清除DPPH·的能力低于藤椒多酚，可能是由于多酚在藤椒冷榨過程中更多的留在了藤椒油中。

圖8 樣品質(zhì)量濃度變化對多酚清除DPPH·作用的影響Fig.8 Effect of sample mass concentration on removal of DPPH· from polyphenols

3 結(jié) 論

利用微波輔助提取技術(shù)，采用正交試驗對藤椒冷榨油餅粕中的多酚類物質(zhì)的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，料液比對餅粕多酚的得率影響最大，其次依次是微波功率、微波處理時間、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)，各因素對多酚得率的影響均極顯著。微波輔助提取藤椒冷榨油餅粕多酚的最佳工藝條件是料液比1∶25、微波處理360 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、微波功率400 W、提取溫度60 ℃，在此條件下的多酚得率為(6.83±0.09) mg/g。按上述工藝條件提取藤椒多酚，得率為(15.45±0.09) mg/g。

通過對比3種不同極性的大孔樹脂(HPD600、AB-8、D-101)對餅粕多酚的純化效果，結(jié)果表明，AB-8型大孔樹脂對藤椒多酚的純化效果最好。AB-8純化餅粕多酚的最佳工藝條件為：上樣液pH為4、多酚濃度為0.53 mg/mL，以1.00 mL/min流速上樣，采用60%乙醇以1.00 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。純化后，餅粕多酚的純度由(35.70±2.87)%提高到(76.30±3.28)%。同樣的方法純化藤椒多酚，藤椒多酚的純度由(29.52±1.72)%增加到了(70.20±2.74)%。

藤椒冷榨油餅粕中殘留有一定的多酚類物質(zhì)和抗氧化活性，具有一定的開發(fā)利用潛力。