豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的鑒定和耐藥性研究

楊 方，崔明全，張純萍，趙 琪，宋 立，徐士新

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）在1957年，被Pattison等人首次報(bào)道［1］，并被國(guó)際公認(rèn)為危害豬養(yǎng)殖業(yè)的三大呼吸道傳染病之一［2］。豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuralpneumoniae，APP）是一種重要的經(jīng)濟(jì)性病原體，屬巴氏桿菌科放線桿菌屬［3-4］，革蘭氏陰性菌，顯微鏡下觀察多呈球桿狀［5］。根據(jù)APP生長(zhǎng)是否需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）將其分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型［6］。APP血清型眾多，不同國(guó)家、不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型不同，我國(guó)主要流行血清型有 1、2、3、4、5、7 和 10 型，以 1、3、7 型為主［7］。

APP與副豬嗜血桿菌相似，在實(shí)驗(yàn)室鑒定診斷時(shí)極易混淆，準(zhǔn)確快速鑒定出病原菌尤為重要。APP血清型具有多樣性且不同血清型菌株毒力不同，血清型和毒力的鑒定給豬傳染性胸膜肺炎診斷與免疫防控帶來(lái)很大難度。臨床中防治該病常使用阿莫西林和頭孢類(lèi)藥物，但效果并不理想，且長(zhǎng)期使用該類(lèi)藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥性，并影響豬肉的質(zhì)量［8］，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失［9］，因此在治療時(shí)應(yīng)結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇抗菌藥物。鑒于此，研究比較了傳統(tǒng)與新型鑒定方法，鑒定國(guó)內(nèi)流行致病性血清型和毒力表型，并測(cè)定大量菌株對(duì)常用抗革蘭氏陰性菌和廣譜抗生素的耐藥性，比較了不同血清型的耐藥性差異，以期為臨床提供迅速準(zhǔn)確的鑒定方法，指導(dǎo)臨床合理用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有45株菌，其中30株APP為2009年中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存的臨床分離菌株。15株APP為2016年從河南地區(qū)豬場(chǎng)病死豬分離所得。質(zhì)控菌株ATCC 25922由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。

1.1.2 主要儀器和試劑 胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。氧化型輔酶Ⅰ（NAD）購(gòu)自羅氏公司。胎牛血清（FAD）購(gòu)自德國(guó)PAN Biotech公司?；|(zhì)CHCA購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司。微量生化反應(yīng)試劑購(gòu)自杭州濱河微生物試劑有限公司。2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自北京博邁德公司。DL 2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司。MALDI TOF微生物鑒定儀器購(gòu)自島津公司。

1.1.3 動(dòng)物 6 周齡 Balb／c 小鼠，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無(wú)菌采取河南地區(qū)豬場(chǎng)病死豬肺臟和脾臟病料接種于添加NAD和FAD的胰蛋白大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，并選取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 革蘭氏染色鏡檢 選取疑似單個(gè)菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3 生化鑒定 無(wú)菌操作挑取純化后的單個(gè)菌落分別接種于乳糖、尿素、蔗糖等微量生化發(fā)酵管中（含添加NAD及FAD的TSB培養(yǎng)基），置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察發(fā)酵結(jié)果。

1.2.4 PCR 分子鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)［10］合成一段 APPⅣ毒素基因的特異性引物。上游：5＇-TTATCCGAACTTTGGTTTAGCC-3＇，下游：5＇-CATATTTGATAAAACCATCCGTC-3＇。目標(biāo)產(chǎn)物片段大小約為417 bp。DNA的提取參考文獻(xiàn)水煮方法［11］，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94℃ 40 s，65℃ 40 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察分析。

1.2.5 MALDI TOF 微生物學(xué)鑒定 選取 1～2 個(gè)純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落，加入600 μL 70%乙醇，混勻；12000 r／min離心2 min，棄去上清；在沉淀中加入50 μL 70%甲酸，混勻，再加入 50 μL 乙腈，混勻，12000 r／min離心2 min，吸出上清；在上樣板上先點(diǎn)1 μL上清，待干后再點(diǎn)2 μL CHCA 基質(zhì)，放干后上樣檢測(cè)。

1.2.6 血清型鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)［12-13］合成一段APPapxⅣ基因特異性引物序列。本研究中使用的引物在表1中詳細(xì)說(shuō)明。1型和7型反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，63 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；3型反應(yīng)條件：95℃5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 90 s，72 ℃ 2 min，25 個(gè)循環(huán)；68 ℃ 15 min。

表1 研究中使用的引物Tab 1 Primers used in this study

1.2.7 血清毒力鑒定 選取血清型為 1、3、7 型的菌株各一株，純化培養(yǎng)后選取單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h。首先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，稀釋菌液濃度為1×107～8×109CFU／mL，每個(gè)稀釋度 200 μL 腹腔注射5只小鼠，持續(xù)觀察1周，并統(tǒng)計(jì)致90%和致10%小鼠死亡的菌液濃度，以此為正式試驗(yàn)的菌濃度界限。在此范圍內(nèi)2倍倍比稀釋菌液濃度，每個(gè)濃度梯度注射10只小鼠，設(shè)置6只注射同等濃度生理鹽水的小鼠為空白對(duì)照，觀察1周，統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡情況。

1.2.8 藥敏試驗(yàn) 參考CLSI的標(biāo)準(zhǔn)，用微量肉湯稀釋法［14］測(cè)定45株APP對(duì)34種常用抗革蘭氏陰性菌及廣譜抗生素的MIC值。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC 25922。

2 結(jié) 果

2.1 革蘭氏染色鏡檢 取待測(cè)菌株單菌落進(jìn)行涂板染色，于顯微鏡油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，可見(jiàn)細(xì)菌為革蘭氏陰性，多呈短桿狀，兩極著色明顯（圖1）。

圖1 革蘭氏染色結(jié)果Fig 1 Results of gram staining

2.2 生化鑒定 取待測(cè)的細(xì)菌純化培養(yǎng)物于各生化鑒定管中，37℃條件下培養(yǎng)24 h，由表2可知，待測(cè)菌株均能夠發(fā)酵乳糖、尿素、麥芽糖等。不發(fā)酵阿拉伯糖、棉子糖、核糖等。符合APP的生化特性。

表2 生化鑒定結(jié)果Tab 2 Results of biochemical identification

2.3 PCR鑒定結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%核酸凝膠電泳，在凝膠成像儀中可見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物在417 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，且與陽(yáng)性對(duì)照菌株條帶位置一致（圖2）。

2.4 MALDI TOF微生物學(xué)鑒定 將待測(cè)菌株經(jīng)過(guò)MALDI TOF微生物鑒定制樣方法提取DNA后上樣檢測(cè)，以ATCC 25922為標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行校準(zhǔn)，鑒定結(jié)果可得到峰比對(duì)率高達(dá)91.5%，鑒定為巴氏桿菌科放線桿菌屬（圖3）。

2.5 鑒定方法比較 對(duì)45株菌分別用革蘭氏染色鏡檢、生化試劑鑒定、PCR分子鑒定、MALDI TOF微生物學(xué)鑒定四種方法進(jìn)行鑒定，以PCR分子鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，從菌株培養(yǎng)操作時(shí)間和準(zhǔn)確率方面進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)四種方法中以MALDI TOF微生物學(xué)鑒定方法最佳，操作方便快捷、準(zhǔn)確率高（表3）。

圖2 培養(yǎng)菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig 2 PCR test results of cultured strains

圖3 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922鑒定結(jié)果（A）和培養(yǎng)菌株鑒定結(jié)果（B）Fig 3 Identification results of standard strain ATCC 25922（A） and culture strain （B）

表3 鑒定方法的比較Tab 3 Comparison of identification methods

表4 血清型1、3、7型分離率Tab 4 Results of serotype 1，3 and 7 separation rate

2.6 血清型鑒定 用PCR方法鑒定45株待測(cè)菌株，結(jié)果見(jiàn)表4。血清型1型菌株13株分離率為28.9%，血清型3型菌株20株分離率為44.4%，血清型7型菌株7株分離率為15.6%，其余5株菌株非1型、3型和7型。

2.7 血清型毒力鑒定 經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定菌液濃度范圍分別為血清型1 型：1×109～0.625×108CFU／mL；血清型 3 型：2×109～1.25×108CFU／mL；血清型7型：4×109～2.5×108CFU／mL。 小鼠死亡情況如表4，根據(jù)寇氏法［15］計(jì)算出三種血清型的半數(shù)致死量分別為 2.04×108CFU／mL、4.08×108CFU／mL、1.07×109CFU／mL。 由表 5 可見(jiàn)，血清 1 型致病力強(qiáng)于3型，血清3型致病力強(qiáng)于7型。

2.8 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，替卡西林對(duì)質(zhì)控菌株 ATCC 25922 的 MIC 為 4～16 μg／mL，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的MIC為8 μg／mL，實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)操作符合標(biāo)準(zhǔn)。以CLSI已有的APP藥敏結(jié)果為判定標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)MIC結(jié)果分析，得出APP對(duì)氟苯尼考、頭孢類(lèi)等高度敏感，對(duì)四環(huán)素類(lèi)耐藥性較高（表6）。分別測(cè)定血清型 1型（13株）、3型（20株）、7型（7株）的耐藥性，結(jié)果顯示強(qiáng)毒力血清型1型對(duì)四環(huán)素類(lèi)（包括四環(huán)素、多西環(huán)素、金霉素、土霉素）耐藥率均高于3型，3型高于7型，且血清1型對(duì)泰樂(lè)菌素、卡那霉素、慶大霉素等的MIC值明顯高于3型及7型（表6）。同時(shí)比較了2009年分離的30株和2016年分離的15株APP的耐藥性變化，發(fā)現(xiàn)2016年分離的菌株對(duì)四環(huán)素、土霉素、金霉素、多西環(huán)素的耐藥率明顯高于2009年分離的菌株（表7）。

表5 血清型1、3、7型菌株對(duì)小鼠的致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Pathogenicity test results of serotype 1，3 and 7 strains on mice

表6 APP對(duì)抗生素的MIC分布和耐藥率Tab 6 MIC distribution and resistance rate of APP to antibiotics

續(xù)表

表7 2009年和2016年APP耐藥性變化Tab 7 Change of drug resistance of APP between in 2009 and in 2016

3 討 論

分離鑒定APP是實(shí)驗(yàn)室診斷豬傳染性胸膜肺炎的重要途徑，多用傳統(tǒng)方法和PCR分子鑒定方法［16］。本實(shí)驗(yàn)分別通過(guò)革蘭氏染色鏡檢、生化試劑鑒定、PCR分子鑒定對(duì)45株APP進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)鑒定方法操作復(fù)雜、準(zhǔn)確率相對(duì)較低、重復(fù)性稍差，PCR鑒定方法準(zhǔn)確率高，但操作費(fèi)時(shí)。MALDI TOF微生物學(xué)鑒定方法目前主要應(yīng)用于臨床樣本中微生物的鑒定［17］。本研究首次運(yùn)用MALDI TOF方法對(duì)45株APP進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)該方法操作簡(jiǎn)單快捷，準(zhǔn)確率高，可重復(fù)性好，適用于樣本數(shù)量多的鑒定方法。綜上研究可知MALDI TOF微生物學(xué)鑒定方法最佳，適用于臨床快速鑒定細(xì)菌并進(jìn)而開(kāi)展藥敏篩查。

了解我國(guó)APP的主要流行致病血清型對(duì)于流行病學(xué)追蹤、細(xì)菌的研究及治療豬傳染性胸膜肺炎都有重要作用。準(zhǔn)確鑒定致病血清型對(duì)臨床診斷至關(guān)重要，傳統(tǒng)的血清型鑒定方法基于抗體反應(yīng)，但是交叉反應(yīng)嚴(yán)重［18］。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前血清型鑒定方法主要是運(yùn)用PCR分子生物學(xué)，該方法操作簡(jiǎn)單準(zhǔn)確率高。本研究通過(guò)PCR分子實(shí)驗(yàn)鑒定了我國(guó)主要流行血清型1型、3型、7型，發(fā)現(xiàn)待測(cè)株菌中血清3型所占比例最大。流行致病血清型及毒力鑒定對(duì)臨床治療該病會(huì)有很大幫助。本研究測(cè)定的血清毒力結(jié)果與田永祥等［19］報(bào)道的一致，并在此基礎(chǔ)上比較了血清7型的毒力。對(duì)比三種血清型的半數(shù)致死量，發(fā)現(xiàn)血清1型毒力強(qiáng)于3型，3型強(qiáng)于7型。

臨床中治療豬傳染性胸膜肺炎主要使用抗生素，而APP容易產(chǎn)生耐藥性，所以在預(yù)防及治療方面有一定的困難，測(cè)定其MIC值，對(duì)解決這一難題有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)2009年分離保存的30株和2016年分離保存的15株APP進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。目前CLSI僅制定了APP對(duì)四環(huán)素類(lèi)、頭孢類(lèi)、氟苯尼考的折點(diǎn)，對(duì)其他藥物暫無(wú)相關(guān)判定標(biāo)準(zhǔn)，本研究測(cè)定的藥敏數(shù)據(jù)對(duì)制定APP對(duì)其他藥物的折點(diǎn)具有重要意義。研究結(jié)果表明，45株APP對(duì)氟苯尼考和頭孢類(lèi)抗生素高度敏感，對(duì)四環(huán)素、金霉素、土霉素等耐藥性較強(qiáng)，耐藥率分別為24.4%、20%、15.6%。APP對(duì)羅紅霉素、恩諾沙星、氨芐西林等抗生素的 MIC50值僅為 0.5 μg／mL，而對(duì)磺胺嘧啶、磺胺異惡唑的 MIC50值分別高達(dá) 265 μg／mL、64 μg／mL。對(duì)比2009年和2016年APP的耐藥差異，發(fā)現(xiàn)2016年分離的APP對(duì)四環(huán)素、金霉素、土霉素、多西環(huán)素的耐藥性明顯高于2009年分離的菌株，且對(duì)比2009年和2016年APP的藥敏結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MIC值明顯增大。其原因可能與近幾年抗菌藥物使用量增加有關(guān)。據(jù)中國(guó)獸藥協(xié)會(huì)的年度抗菌藥物原料藥生產(chǎn)統(tǒng)計(jì)［20］，我國(guó)獸用抗菌藥物原料藥銷(xiāo)售量由2009年的28400噸，增加到2016年50400噸。

我國(guó)APP主要流行的致病血清型為1、3、7型［21］，因此研究比較了國(guó)內(nèi)流行的三種血清型的耐藥性特點(diǎn)。不同血清型對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素的耐藥性存在明顯差異，血清型1型對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素多表現(xiàn)為耐藥性，耐藥率高于30.8%。血清型1型對(duì)四環(huán)素類(lèi)耐藥率高于3型，3型高于7型，且血清1型的MIC值明顯高于血清3型，3型高于7型，說(shuō)明不同毒力血清型耐藥性有差異，強(qiáng)毒力血清型耐藥率相對(duì)更高。但是我們關(guān)注強(qiáng)毒力型細(xì)菌耐藥性高是否也導(dǎo)致致病性更強(qiáng)，由于未開(kāi)展有關(guān)研究，尚無(wú)法得出結(jié)論，仍需進(jìn)一步研究。

在臨床中使用抗生素治療豬傳染性胸膜肺炎時(shí)應(yīng)注意合理用藥，關(guān)注耐藥性變化趨勢(shì)，防范于未然，減少耐藥菌株的出現(xiàn)。本研究通過(guò)比較鑒定方法及分析藥敏數(shù)值，為臨床折點(diǎn)制定提供數(shù)據(jù)支撐，對(duì)臨床中豬傳染性胸膜肺炎的診斷治療提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為該病的防控及獸醫(yī)臨床抗生素的使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。