遲緩愛德華菌T3SS轉(zhuǎn)位因子EseC促炎反應(yīng)

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遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda，簡稱Et)屬于腸桿菌科愛德華菌屬，分布廣泛，可感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類、哺乳類及人類。Et能夠侵染多種魚類，引起敗血癥為特征的感染,即遲緩愛德華菌病 (Edwardsiellasis)[1-2]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system，T3SS)是細(xì)菌中一種接觸依賴性的、向宿主細(xì)胞中靶向轉(zhuǎn)運(yùn)毒力因子的裝置，是細(xì)菌一種重要的毒力因子[3]。Et的主要分泌蛋白(Et secretory protein, EseC)是T3SS一種轉(zhuǎn)位因子。已有研究發(fā)現(xiàn)，Et菌eseC基因缺失后，引起Et菌毒力的改變[4]。本研究通過比較eseC基因缺失株和野生株分別感染細(xì)胞和組織，探討Et菌T3SS和感染的細(xì)胞、組織，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的關(guān)系及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1菌株和培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)涉及的菌株和質(zhì)粒見表1，強(qiáng)毒株Et.CD由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陸承平教授惠贈(zèng)。細(xì)菌采用LB(Luria Broth)培養(yǎng)基來培養(yǎng)。

表1 菌種及質(zhì)粒Tab.1 A list of the strains and plasmid used in the study

1.2小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。TRIzol Reagent 試劑，Reverse Transcriptase M-MLV試劑購自Invitrogen公司。BALB/c二級小鼠，6周齡，雌性，購自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物模式中心。

1.3eseC基因缺失株及其互補(bǔ)株的構(gòu)建和鑒定 方法參考文獻(xiàn)[5]，以Et.CD的全基因組為模板，用引物eseC-F1-F/R和eseC-F2-F/R(見表2)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增eseC基因的兩側(cè)片段F1和F2，并連接到自殺質(zhì)粒pHM5，命名重組質(zhì)粒為pHM-F1F2。用接合方法將該重組質(zhì)粒從SM10λpir轉(zhuǎn)移到Et.CD，在Ampr和Colr雙抗LB平板上，得到含pHM-F1F2的Et.CD菌落。含重組質(zhì)粒的Et.CD菌落接種LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，在Colr和10%蔗糖的LB平板上，篩選到自殺性質(zhì)粒脫離的eseC基因缺失株。進(jìn)一步用PCR鑒定eseC基因缺失株，反復(fù)傳代后，篩選一株穩(wěn)定表達(dá)的缺失株。

表2 用于構(gòu)建和鑒定eseC基因缺失株和互補(bǔ)株的引物Tab.2 Primers used to construct and identify the eseC mutant and complementary strain

以Et.CD基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增eseC基因的片段，引物序列見表2，eseC基因和載體pACYC184連接，得到重組質(zhì)粒pACYC-eseC。通過電擊法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到eseC基因缺失株，在CmrLB平板上，得到含pACYC-eseC的Et.CD菌落，PCR鑒定為eseC基因互補(bǔ)株。

1.4細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)期E.coliBL21、Et.CD野生株、eseC基因缺失株和互補(bǔ)株分別感染RAW264.7巨噬細(xì)胞，方法參考文獻(xiàn)[6]，以培養(yǎng)時(shí)間1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h為橫坐標(biāo)，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的活菌數(shù)(CFU/cell)為縱坐標(biāo)，取3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，繪制細(xì)菌胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)目和時(shí)間曲線。

1.5CCK-8法檢測細(xì)菌株感染巨噬細(xì)胞后的細(xì)胞存活率 分別以不同的MOI(1∶1、1∶10、1∶100)對數(shù)期Et.CD野生株、eseC基因缺失株和互補(bǔ)株，感染96孔板中RAW264.7細(xì)胞2 h，PBS漂洗細(xì)胞3遍，每孔加入10 μL CCK-8溶液，以不加細(xì)胞的孔作為空白對照，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。用酶標(biāo)儀在450 nm處測定各孔的吸光值，取3個(gè)平行對照孔的平均值。細(xì)胞存活率=(處理細(xì)胞孔的吸光度-空白對照孔吸光度)/(未處理細(xì)胞孔的吸光度-空白對照孔吸光度)×100%。

1.6Annexin V-FITC檢測細(xì)胞壞死 以10∶1 MOI Et.CD野生株、eseC基因缺失株和互補(bǔ)株分別感染RAW264.7巨噬細(xì)胞2 h或6 h，方法參考文獻(xiàn)[7]，用流式細(xì)胞儀檢測：細(xì)胞壞死率=壞死細(xì)胞/所有細(xì)胞×100% (Ex:488 nm; Em:530 nm)。

1.7細(xì)菌在小鼠體內(nèi)存活實(shí)驗(yàn) 方法參考文獻(xiàn)[7]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組：Et.CD野生株組、eseC基因缺失株組和PBS對照組。腹腔注射每只小鼠的細(xì)菌劑量200 μL, 5×106cfu/mL；在感染后不同時(shí)間點(diǎn)12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、15 d和21 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)斷脊處死每組3只小鼠，無菌操作迅速取出肝臟、肺臟、脾臟和腎臟，各加入1 mL含有0.1% TritonX-100的PBS，用玻璃勻漿器制成勻漿，取組織勻漿進(jìn)行10倍系列稀釋，選取適當(dāng)稀釋度的勻漿液100 μL涂LB平板，計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組不同組織內(nèi)細(xì)菌CFU/mL的平均值。

1.8細(xì)菌感染后小鼠組織病理的改變 細(xì)菌感染小鼠的方法同1.7，斷脊處死小鼠，迅速解剖，取出小鼠的肝臟、肺臟、脾臟和腎臟進(jìn)行觀察；先用PBS洗去血液，再浸于10%中性福爾馬林溶液中固定48 h；經(jīng)沖洗、脫水、常規(guī)石蠟包埋，制成切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，Olympus BX50生物顯微鏡觀察。

1.9ELISA檢測小鼠血清細(xì)胞因子IL-1β和 TNF-α 細(xì)菌感染小鼠的方法同1.7，毛細(xì)玻璃管采小鼠眼球血，方法同試劑說明書，加入稀釋250倍的抗相關(guān)細(xì)胞因子的抗體的包被液，4 ℃過夜；洗滌后，再加入相關(guān)細(xì)胞因子稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)空白對照為標(biāo)準(zhǔn)曲線零點(diǎn)。待測血清稀釋10倍，37 ℃ 3 h；洗滌后，加入酶標(biāo)檢測抗體，37 ℃ 1 h；加入稀釋250倍的親和素-辣根過氧化物酶，37 ℃ 30 min；加底物顯色；終止顯色反應(yīng)；使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值，設(shè)定570 nm作為校正波長。

1.10RT-PCR 按試劑盒說明書，方法參考文獻(xiàn)[7]，分別提取對數(shù)期Et.CD野生株和eseC基因缺失株RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模版，用T3SS效應(yīng)蛋白eseE基因的引物(F-CTTCCTGGAGAGCGAGTT, R-CAGCATCACAT-CCGTCAG)和T3SS效應(yīng)蛋白eseJ基因的引物(F-GGAT TATGATGATA CGACACAG, R-GCTGATACACCTGCTGATT)分別擴(kuò)增兩基因，以擴(kuò)增16SrRNA基因(F-GATTCGCTGGATGTCAAGA, R-GCTGGTCTGAGAGGATGA)作為內(nèi)標(biāo)參照，定量檢測各基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 比較細(xì)菌存活率之間、細(xì)胞存活率之間和細(xì)胞因子濃度之間的差異，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1比較野生株和eseC基因缺失株在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的差異 如圖1顯示，E.coliBL21不能在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長繁殖的，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，胞內(nèi)細(xì)菌的數(shù)目逐漸減少；野生株和eseC基因缺失株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目在一段時(shí)間內(nèi)呈上升趨勢，野生株在延長培養(yǎng)12 h后達(dá)到最高；而eseC基因缺失株在延長培養(yǎng)24 h后達(dá)到最高。在延長培養(yǎng)到6 h和12 h時(shí)，缺失株胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)目明顯低于野生株(t=7.046,t=4.406;P<0.05)，互補(bǔ)株的變化趨勢接近野生株。這表明eseC基因?qū)τ诰S持Et在巨噬細(xì)胞內(nèi)的繁殖速率起重要的作用。

*：表示P<0.05圖1 比較野生株和eseC基因缺失株在巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)目的差異Fig.1 Comparison of the differences between the bacterial numbers of the wild type and ΔeseC strains within macrophages

2.2比較野生株和eseC基因缺失株株感染巨噬細(xì)胞后的細(xì)胞存活率 結(jié)果如圖2表明，當(dāng)MOI為10∶1和100∶1時(shí)，野生株感染巨噬細(xì)胞后的細(xì)胞存活率明顯低于缺失株組(t=27.67,t=27.33;P<0.05)，互補(bǔ)株組與野生株組的細(xì)胞存活率沒有明顯差別(t=2.48,P>0.05)，說明eseC基因缺失后，Et感染巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞存活率明顯降低。

*：表示P<0.05圖2 比較野生株和eseC基因缺失株對巨噬細(xì)胞毒性的差異Fig.2 Comparison of the differences between the toxicity to the macrophages infected by the wild type and the one by ΔeseC strains

2.3比較野生株和eseC基因缺失株誘發(fā)巨噬細(xì)胞壞死的差異 細(xì)菌感染細(xì)胞2 h流式結(jié)果如圖3所示：未感染細(xì)菌的細(xì)胞雙染對照組，早期壞死的比率為0.87%(圖3A)；Et野生株組早期細(xì)胞壞死率為11.11%(圖3B)，缺失株組早期細(xì)胞壞死率為3.85%，互補(bǔ)株組早期細(xì)胞壞死率為4.44%(圖3D)。細(xì)菌感染細(xì)胞6 h流式結(jié)果如圖3所示: 未感染細(xì)菌的細(xì)胞雙染對照組，晚期壞死的比率為1.24%(圖3E)；Et野生株組晚期細(xì)胞壞死的比率為38.05%(圖3F)；缺失株組晚期細(xì)胞壞死率為20.36%(圖3G)；互補(bǔ)株組晚期細(xì)胞壞死率為37.10%(圖3H)。因此，Et可通過其三型分泌系統(tǒng)早期或晚期均誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生壞死。

2.4比較野生株和eseC基因缺失株感染小鼠，在肝、肺、脾和腎中細(xì)菌存活數(shù)目的差異 如圖4顯示，和野生株比較，缺失株雖然也入侵肝臟、脾臟、腎臟和肺臟，但在這些器官內(nèi)檢出的細(xì)菌數(shù)量低于野生株，表明eseC基因缺失株在宿主體內(nèi)的細(xì)菌存活數(shù)目明顯降低。

2.5比較野生株和缺失株感染小鼠(腹腔注射)后，引起小鼠組織的病理改變的差異 如圖5所示：野生株和eseC缺失株分別感染小鼠3～5 d時(shí),發(fā)現(xiàn)野生株組肝臟、脾臟和肺臟與對照組的外觀差異顯著，缺失株組與對照組的外觀差異無顯著；野生株組的腎臟、缺失株組和對照組的外觀在小鼠感染各個(gè)時(shí)期均未有明顯的差別。

PBS對照組小鼠肝臟(圖6A)、脾臟(圖6D)、肺臟(圖6G)和腎臟(圖6J)的結(jié)構(gòu)清楚，組織細(xì)胞無水腫、無壞死。細(xì)菌感染小鼠后，組織病理變化最明顯的時(shí)間是：肝臟(3 d)、脾臟(3 d)、肺臟(5 d)和腎臟(7 d)(見圖6)。野生株感染組織的主要病理改變：大量的炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞水腫和變性(圖6B)、脾竇擴(kuò)張和充血(圖6E)、肺泡上皮細(xì)胞變性和壞死(圖6K)、腎小管上皮細(xì)胞變性和壞死(圖6K)，這些提示野生株對小鼠的肝臟，脾臟、肺臟和腎臟有明顯的急性炎癥反應(yīng)和毒性作用，而eseC基因缺失株對肝臟(圖6C)，脾臟(圖6F)、肺臟(圖6I)腎臟(圖6L)的急性炎癥反應(yīng)和毒性作用均明顯減輕。這說明eseC基因缺失以后，Et菌對宿主的病理損傷明顯減輕。

圖3 比較野生株和eseC基因缺失株感染巨噬細(xì)胞誘發(fā)細(xì)胞壞死率的差異Fig.3 Comparison of the differences between the cell necrosis rates of macrophages infected by the wild type and the ones did by the ΔeseC strain

圖4 比較野生株和eseC基因缺失株在小鼠組織中存活數(shù)的差異Fig.4 Comparison of differences between the survival numbers of the wild type and the ones of the ΔeseC strains in the tissues of mice

圖5 比較野生株和eseC缺失株感染小鼠后組織外觀的差異Fig.5 Comparison of difference between the tissue sizes of mice infected by the wild type and ones did by the ΔeseC strains

圖6 比較野生株和eseC基因缺失株感染小鼠后各組織病理改變的差異(×400)Fig.6 Comparison of difference between pathological damage of the tissues of mice infected by the wild type and the ones did by the ΔeseC strain(×400)

2.6比較野生株和eseC基因缺失株感染小鼠血清IL-1β和TNF-α濃度的差異 感染1-11 d后，野生株組中小鼠血清中的IL-1β和TNF-α的濃度均明顯高于缺失株組(t=2.979,t=3.103;P<0.05)。感染后1 d時(shí)，野生株組中小鼠血清中IL-1β的濃度達(dá)到了最高，且明顯高于缺失株組(t=6.748，P<0.05)(圖7A)；感染后3 d時(shí)，野生株組小鼠血清中TNF-α的濃度達(dá)到了最高，且明顯高于缺失株(t=5.237，P<0.05)(圖7B)。結(jié)果表明，eseC的缺失影響了Et誘發(fā)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

2.7RT-PCR檢測eseC基因?qū)3SS效應(yīng)蛋白的作用 結(jié)果如圖8所示：eseC基因缺失株T3SS效應(yīng)蛋白基因eseE和eseJ的轉(zhuǎn)錄水平和野生株相比明顯降低，而互補(bǔ)株的eseE和eseJ的轉(zhuǎn)錄水平與野生株之間并未有明顯差別。這表明eseC基因的缺失影響了效應(yīng)蛋白EseE和EseJ分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)。

圖8 比較野生株和eseC基因缺失株的T3SS效應(yīng)蛋白基因eseE和eseJ轉(zhuǎn)錄水平的差異Fig.8 Comparison of the differences between the transcriptional levels of eseE and eseJ of the wild type and the ones of the ΔeseC strains

3 討 論

Et菌T3SS的基因簇由35個(gè)開放閱讀框構(gòu)成，以毒力島的形式存在于細(xì)菌的染色體上，Et 菌的毒力島與鼠傷寒沙門氏毒力島(SalmonellatyphimuriumPathogenicity island SPI-2)有較高的同源性[3]。沙門氏SPI-2拷貝的T3SS有助于該菌的系統(tǒng)感染[8]， 因此，我們選擇將Et菌腹腔注射途徑，研究Et菌T3SS的功能。

根據(jù)T3SS功能可大致分為4類[3]：①裝置蛋白，其中 EseB、EseC和EseD組成T3SS的尖端結(jié)構(gòu)，被稱為轉(zhuǎn)位子蛋白(translocon)；②效應(yīng)蛋白，這是III型分泌系統(tǒng)發(fā)揮毒力的部分，可以直接通過分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對宿主細(xì)胞的影響；③伴侶蛋白；④調(diào)節(jié)蛋白。Xie等研究表明，效應(yīng)蛋白EseG可影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的微管結(jié)構(gòu)重排，與細(xì)菌的致病機(jī)制有關(guān)[9]；效應(yīng)蛋白eseJ基因缺失株不能在上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖，并且其毒力比野生株顯著降低[10]。

Et菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，能夠在吞噬細(xì)胞存活和繁殖，最終釋放出來，擴(kuò)散到宿主全身。因此，我們比較了Et.CD野生株和eseC基因缺失株在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活率和細(xì)胞存活率的結(jié)果，說明野生株感染細(xì)胞后，引起更多細(xì)胞的死亡，釋放出更多細(xì)菌成份，如LPS 和T3SS，這些細(xì)菌成份為病原體相關(guān)模式分子(Pathogen associated molecular pattern, PAMP)可以誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)[11]。我們比較野生株和eseC基因缺失株誘發(fā)巨噬細(xì)胞壞死的結(jié)果表明，野生株可通過其T3SS誘導(dǎo)更多巨噬細(xì)胞發(fā)生壞死。細(xì)胞炎性壞死，伴有大量促炎癥因子的釋放[11]。此外，我們比較野生株和eseC基因缺失株感染小鼠，在肝、肺、脾和腎中細(xì)菌存活數(shù)目的結(jié)果表明，T3SS有助于野生株在組織中的大量增殖。

我們采用動(dòng)物體內(nèi)的研究表明，野生株感染小鼠后，它們的肝臟，脾臟、肺臟和腎臟有明顯的急性炎癥反應(yīng)，外觀明顯腫大，eseC基因缺失株感染小鼠后，這些組織的急性炎癥反應(yīng)明顯減輕。野生株誘發(fā)小鼠血清炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β濃度的產(chǎn)生明顯高于缺失株。我們進(jìn)一步用RT-PCR檢測eseC基因?qū)3SS效應(yīng)蛋白EseE和EseJ的作用，結(jié)果表明， EseC 缺失影響了效應(yīng)蛋白EseE和EseJ分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)，影響了Et的致炎作用。