耐藥嗜水氣單胞菌毒力與六類抗菌藥物耐藥元件基因研究

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嗜水氣單胞菌是典型的人和動物(含水生動物)共患病病原菌。人腸道感染嗜水氣單胞菌可導(dǎo)致腹瀉,嗜水氣單胞菌亦可導(dǎo)致人皮膚及軟組織感染,部分免疫力低下者甚至引發(fā)敗血癥和腹膜炎以及腹腔臟器膿腫[1]。近年來國內(nèi)有關(guān)嗜水氣單胞菌的臨床報道有所增加[2-5], 嗜水氣單胞菌的耐藥性雖然遠低于革蘭氏陰性腸桿菌(如肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌及陰溝腸桿菌),但部分嗜水氣單胞菌臨床分離株對常用的抗菌藥物有一定的耐藥率[1-5]。近年國內(nèi)涉及到的嗜水氣單胞菌研究注重臨床病例報道及耐藥性分析[1-5]。李淑妃等作了嗜水氣單胞菌的毒力基因研究[6],翁幸鐾等作了嗜水氣單胞菌的β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類藥物的耐藥基因研究[7]。國內(nèi)缺乏耐藥嗜水氣單胞菌的毒力與耐藥元件基因的聯(lián)合檢測研究報道。為此,我們對收集到的10株耐藥嗜水氣單胞菌進行了3種毒力基因與六類抗菌藥物54種耐藥元件基因檢測,并以1株對常用抗菌藥物敏感的嗜水氣單胞菌作為參照株。本研究并對全部基因的檢測結(jié)果分別作樣本聚類分析。

1 材料與方法

1.1菌株來源 10株耐藥嗜水氣單胞菌分離自2014年1月至2017年10月本院內(nèi)科住院病人，其中血液3例，腹水4例，膿液3例。1株對常用抗菌藥物敏感的嗜水氣單胞菌亦為同期醫(yī)院分離的菌株。

1.2藥敏試驗與AmpC酶三維試驗 嗜水氣單胞菌13種抗菌藥物敏感性試驗為K-B藥敏紙片法。藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品。10株耐藥嗜水氣單胞菌敏感試驗結(jié)果見表1。1株參照株嗜水氣單胞菌對該13種抗菌藥物均為敏感。本文1、2、5、6、7、9號菌株AmpC酶三維試驗呈陽性。

1.3菌體DNA制備 嗜水氣單胞菌菌體DNA制備為非離子去污劑裂解聯(lián)合蛋白酶K消化法。菌體DNA制備試劑盒裂解液A(非離子去污劑)與裂解液B(蛋白酶K)由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。挑取單個菌落放入菌體DNA制備試劑盒提供的裂解液A(非離子去污劑)與裂解液B(蛋白酶K)混合液中,然后55 ℃水浴裂解消化細菌細胞膜60 min,再95 ℃水浴滅活蛋白酶K活性10 min即為基因檢測的模板液。

1.4基因檢測 10株耐藥嗜水氣單胞菌3種毒力基因與6類抗菌藥物54種耐藥元件基因檢測均為PCR法。54種耐藥元件基因為參考近年國內(nèi)外對嗜水氣單胞菌耐藥基因檢測結(jié)果[7-9],并參照革蘭氏陰性桿菌可能存在的耐藥元件基因而確定。實驗并設(shè)1株對13種抗菌藥物均為敏感的嗜水氣單胞菌作為參照株。3種毒力基因與六類抗菌藥物54種耐藥元件基因檢測項目見表2。本研究共57種基因引物序列委托無錫新吳區(qū)新克隆數(shù)據(jù)分析工作室設(shè)計并獲授權(quán)使用[7,13]。PCR擴增核心試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。每種毒力與耐藥元件基因的PCR擴增體系均為:耐熱DNA聚合酶(rTaq DNA pol,日本Takara公司產(chǎn)品)1單位(0.2 μL), 與耐熱DNA聚合酶配匹的10倍濃度緩沖液2 μL(日本Takara公司產(chǎn)品)；P1引物2 μL(1.0 μmol/L)，P2引物2 μL(1.0 μmol/L)；dNTPs 2 μL (2 mmol/L)；超純水7 μL,菌株 DNA處理液4.8 μL,合計總體積20 μL。熱循環(huán)為：95 ℃預(yù)變性3 min，然后95 ℃ 0.5 min→55 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min，重復(fù)30周期，最后一輪72 ℃延長至5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳40 min，紫外線下凝膠上出現(xiàn)與陽性對照分子量相同的目的條帶即判別為陽性。

表1 10株嗜水氣單胞菌13種抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果Tab.1 Results of susceptibility tests of 13 antimicrobialagents from 10 Aeromonas hydrophila strains

blaOXA-2群P1:CAGGCGCYGTTCGYGATGAGTT;P2:GCCYTCTATCCAGTAATCGCC 233blaOXA-10群P1:GTCTTTCRAGTACGGCATTA;P2:GATTTTCTTAGCGGCAACTTA 822氨基糖苷類修飾酶基因(10種)aac(3)-ⅠP1:ACCTACTCCCAACATCAGCC;P2:ATATAGATCTCACTACGCGC 169aac(3)-ⅡP1:ACTGTGATGGGATACGCGTC;P2:CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA 237aac(3)-ⅢP1:CACAAGAACGTGGTCCGCTA;P2:AACAGGTAAGCATCCGCATC 185aac(3)-ⅣP1:CTTCAGGATGGCAAGTTGGT;P2:TCATCTCGTTCTCCGCTCAT 286aac(6')-ⅠbP1:ATGACTGAGCATGACCTTGC;P2:TTAGGCATCACTGCGTGTTC 519aac(6')-ⅡP1:TTCATGTCCGCGAGCACCCC;P2:GACTCTTCCGCCATCGCTCT 178ant(3″)-ⅠP1:TGATTTGCTGGTTACGGTGAC;P2:CGCTATGTTCTCTTGCTTTTG 284ant(2″)-ⅠP1:GAGCGAAATCTGCCGCTCTGG;P2:CTGTTACAACGGACTGGCCGC 320aadA5P1:ATGGGTGAATTYTTYCCTGCACAA;P2:TCAACGCAAGATTCTCTCATTCGT 789aph(3')-ⅠP1:ATGTGCCATATTCAACGGGAAACG;P2:TCAGAAAAACTCATCGAGCATCAA 81616SrRNA甲基化酶基因(6種)armAP1:ATGGATAAGAATGATGTTGTTAAG;P2:TTATTTCTGAAATCCACTAGTAATTA 315rmtAP1:CCTAGCGTCCATCCTTTCCTC;P2:AGCGATATCCAACACACGATGG 756rmtBP1:ATGAACATCAACGATGCCCTC;P2:TTATCCATTCTTTTTTATCAAGTATAT 846rmtCP1:ATGAAAACCAACGATAATTATC;P2:TTACAATCTCGATACGATAAAATAC 744rmtDP1:ATGAGCGAACTGAAGGAAAAACTGCT;P2:TCATTTTCGTTTCAGCACGTAAAACAG 774npmAP1:TTGGGTACTGGAGACGGTAG;P2:CAGCTTTGTATTGTTCGCTC 421耐喹諾酮基因(4種)qnrAP1:CAAGAGGATTTCTCACGCCAG;P2:GAACTCTATGCCAAAGCAGTTGG 240qnrBP1:ATGRCTCTGGCAMTMGTTGGCGA;P2:CTARCCAATMAMCGCGATGCCAAG 645gnrSP1:ATGGAAACCTACMRTCAYACATAT;P2:TTAGTCAGGAWAAACAACAATACCC 657qepAP1:GCCGAACGCCGCTGCCGACAG;P2:TGCTGCTGACGCTGGCGCTC 501耐復(fù)方新諾明基因(4種)sul1P1:TAGCGAGGGCTTTACTAAGC;P2:ATTCAGAATGCCGAACACCG 300dfrA1P1:TTGTGAAACTATCACTAATGGTAG;P2:CTTGTTAACCCTTTTGCCAGA 480表2(續(xù))基因分類基因家族引物序列(5'-3')長度/bp

dfrA12P1:ATGAACTCGGAATCAGTACGC;P2:TTAGCCGTTTCGACGCGCAT 498dfrA17P1:TTGAAAATWTCATTGATTTCT;P2:TTAGCCTTTTTTCCAAATCTGRTATGT 474耐氯霉素基因(2種)catBP1:CCSAAYATCAARGTWGGGCG;P2:GGCATGAYCATRGCCTCMGA 320cmlAP1:GTTGGCGGTACTCCCTTGCC;P2:GGCCACCTCCCAGTAGAACG 240可移動遺傳元件標記基因(7種)traAP1:AAGTGTTCAGGGTGCTTCTGCGC;P2:GTCATGTACATGATGACCATTT 272IS26P1:CACATGAACCCATTCAAAGGCC;P2:TCTTTGCCCGTGGCACATGGATGAA 240IS903P1:GCAATACGCACGCTTTCAGGC;P2:ACTGCACGGTTACGGTCTGCA 240ISEcp1P1:CTTCATTGGCATTGATAAGTTAG;P2:TGTAGCATCGGTTTCCCAGTTTC 299intⅠ1P1:CCGAGGATGCGAACCACTTC;P2:CCGCCACTGCGCCGTTACCA 373intⅠ2P1:CACGGATATGCGACAAAAAGGT;P2:GTAGCAAACGAGTGACGAAATG 789intⅠ3P1:GCCTCCGGCAGCGACTTTCAG;P2:GATGCTGCCCAGGGCGCTCG 433

1.5PCR擴增產(chǎn)物DNA序列測定與分析 本研究抽取部分PCR擴增陽性產(chǎn)物委托鉑尚生物技術(shù)公司(上海)作DNA序列測定,測得序列在線BLASTn比對確認(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)。

1.6基于基因檢測結(jié)果的菌株分類 10株耐藥嗜水氣單胞菌和1株敏感嗜水氣單胞菌3種毒力基因與六類抗菌藥物54種耐藥元件基因檢測結(jié)果，委托無錫新吳區(qū)新克隆數(shù)據(jù)分析工作室作UPGMA法樣本聚類分析,以獲得菌株分類結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1毒力與耐藥元件基因檢測 10株耐藥嗜水氣單胞菌檢出毒力基因2種,耐藥元件基因20種。各種基因陽性率見表3。本研究對部分PCR擴增陽性產(chǎn)物作DNA測序分析,圖1～7分別為aerA、blaTEM、blaOXA-1群、aac(3)-Ⅱ、qnrS、catB及cmlA測序圖。

注: 本表未列出檢測結(jié)果為陰性基因的項目

圖1 aerA PCR擴增產(chǎn)物測序圖(經(jīng)BLASTn比對確認aerA)Fig.1 aerA PCR amplification product sequencing

圖2 blaTEM PCR擴增產(chǎn)物測序圖(經(jīng)BLASTn比對確認blaTEM-1)Fig.2 blaTEM PCR amplification product sequencing

圖3 blaOXA-1群 PCR擴增產(chǎn)物測序圖(經(jīng)BLASTn比對確認blaOXA-1)Fig.3 blaOXA-1 group PCR amplification product sequencing

圖4 aac(3)-Ⅱ PCR擴增產(chǎn)物測序圖(經(jīng)BLASTn比對確認aac(3)-Ⅱ)Fig.4 aac(3)-II PCR amplification product sequencing

圖5 qnrS PCR擴增產(chǎn)物測序圖(經(jīng)BLASTn比對確認qnrS)Fig.5 qnrS PCR amplification product sequencing

圖6 catB PCR擴增產(chǎn)物測序圖(經(jīng)BLASTn比對確認catB)Fig.6 catB PCR amplification product sequencing

圖7 cmlA PCR擴增產(chǎn)物測序圖(經(jīng)BLASTn比對確認cmlA)Fig.7 cmlA PCR amplification product sequencing

表4 10株耐藥嗜水氣單胞菌和1株敏感嗜水氣單胞菌3種毒力基因與6類抗菌藥物54種耐藥元件基因檢測結(jié)果經(jīng)樣本聚類分析后的分類狀況Tab.4 Classification results of the detection results of 10 resistance genes of 10 strains of resistant Aeromonas hydrophila and 1 sensitive Aeromonas hydrophila and 54 antimicrobial elements of 6 antibiotics

2.2基因檢測結(jié)果的菌株分類 對10株耐藥嗜水氣單胞菌和1株敏感嗜水氣單胞菌3種毒力基因與六類抗菌藥物54種耐藥元件基因檢測結(jié)果作UPGMA法樣本聚類分析,由圖8可見, 10株耐藥嗜水氣單胞菌和1株敏感嗜水氣單胞菌可分為A與B 2個群。由表4 的為10株耐藥嗜水氣單胞菌和1株敏感嗜水氣單胞菌經(jīng)基因檢測結(jié)果樣本聚類分析后的分類狀況。

注：(圖中數(shù)字為耐藥嗜水氣單胞菌之菌株號,S為參照株)圖8 10株耐藥嗜水氣單胞菌和1株敏感嗜水氣單胞菌3種毒力基因與六類抗菌藥物54種耐藥元件基因檢測結(jié)果樣本聚類分析Fig.8 Cluster analysis of the detection results of the resistance genes of 10 strains of resistant Aeromonas hydrophila and 1 strain of sensitive Aeromonas hydrophila and 54 antimicrobial elements of six antibiotics

3 討 論

嗜水氣單胞菌廣泛存在于水與土壤等自然界,人感染嗜水氣單胞菌后可導(dǎo)致食物中毒(腹瀉)等介水傳染病,皮膚與軟組織感染,嚴重者可導(dǎo)致敗血癥等。

嗜水氣單胞菌之所以能導(dǎo)致人與動物以及水生動物(魚、鱔魚、甲魚、蛙、大鯢等等)炎癥性疾病是因為該菌產(chǎn)多種毒力因子(毒力因子由毒力基因編碼)。hlyA基因表達溶血素(hemolysin)可對宿主細胞構(gòu)成細胞毒性損害。aerA基因表達氣溶素(aerolysin),氣溶素對宿主細胞具有溶血性、細胞毒性和腸毒性。aerA基因缺失的嗜水氣單胞菌毒力減弱。rtxA基因表達產(chǎn)物能導(dǎo)致宿主細胞凋亡[10]。本文對10株耐藥嗜水氣單胞菌進行了上述3種重要的毒力基因進行了檢測,結(jié)果為hlyA基因檢出率為100.00%,aerA基因檢出率為20.00%, 而rtxA基因無檢出。即本文10株耐藥嗜水氣單胞菌中,2株為同時檢出hlyA與aerA基因,8株僅檢出hlyA基因(見表4)。Soltan等曾報道了嗜水氣單胞菌敗血癥患者分離株aerA基因檢出為4/4(100.00%),hlyA基因檢出為2/4(50.00%)。

本文10株耐藥嗜水氣單胞菌由表2 的13種抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果可見,除對亞胺培南全為敏感外,對其它種抗菌藥物的耐藥率在30.00%～80.00%之間,因而本文菌株的耐藥性并不低。

本文10株耐藥嗜水氣單胞菌共檢出6種β-內(nèi)酰胺酶基因(陽性率詳見表3),blaAQU與blaMOX基因表達AmpC型β-內(nèi)酰胺酶,10株中有5株(1、2、5、6、7號菌株)同時檢出blaAQU與blaMOX基因(見表4),9號菌株僅檢出blaMOX基因(見表4),這6株AmpC酶三維試驗均呈陽性。本文10株耐藥嗜水氣單胞菌共檢出5種氨基糖苷類修飾酶基因(陽性率詳見表3),共有6株被檢出氨基糖苷類修飾酶基因,但2株僅檢出ant(3″)-Ⅰ,ant(3″)-Ⅰ型修飾酶僅能滅活鏈霉素(不能滅活慶大霉素與阿米卡星),因此本文6株被檢出氨基糖苷類修飾酶基因的菌株只有4株菌耐慶大霉素與阿米卡星,該4株菌同時檢出多種修飾酶基因(3、5、9、10號株, 見表4)。本文菌株沒有檢出16S rRNA甲基化酶基因,與 Moura等的報道不同[8]。另外,本文菌株耐喹諾酮基因檢出qnrS與qepA,耐復(fù)方新諾明基因sul1與dfrA1,耐氯霉素基因catB與cmlA。上述3類抗菌藥物的耐藥基因檢出率與耐藥率基本一致(見表1和表4)。綜上可見, 10株耐藥嗜水氣單胞菌共檢出β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類、氯霉素類等5類抗菌藥物17種獲得性耐藥基因。這些獲得性耐藥基因往往由可移動遺傳元件介導(dǎo),本研究檢測了7種可移動遺傳元件標記基因,有5株檢出1～3種可移動遺傳元件標記基因(見表4)。

1株敏感嗜水氣單胞菌沒有檢出任何耐藥元件基因,僅檢出hlyA基因(見表4)。由基因檢測結(jié)果樣本聚類分析顯示,它僅與8號株有較近的親緣關(guān)系。

本文對10株耐藥嗜水氣單胞菌經(jīng)3種毒力基因與54種耐藥元件基因同步檢測顯示,每株至少檢出1種毒力基因和2種耐藥基因,這一現(xiàn)象在國內(nèi)為首次報道。嗜水氣單胞菌對抗菌藥物的耐藥率上升必須嚴密監(jiān)測,國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)攜帶mcr-5基因而耐多粘菌素的嗜水氣單胞菌菌株[12]。