烏蘇圖病毒及其人畜動物感染的研究進展

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烏蘇圖病毒(Usustu virus，USUV)屬于黃病毒科黃病毒屬[1],是一種蟲媒病毒，主要宿主是鳥類，由蚊子進行傳播。該病毒于1959年在南非斯威士蘭烏蘇圖河附近的蚊子中被發(fā)現(xiàn)，因此被命名為烏蘇圖病毒。1964年，將攜帶病毒的庫蚊處理后接種新生小鼠大腦中首次分離到病毒[2-3]。1981年，USUV首次在中非一個出現(xiàn)發(fā)熱和皮疹癥狀病人分離出來。2004年，Nikolay 等人在一名布基納法索(非洲國家)男孩身上分離到USUV[4]。2009年，意大利報道在一名病人證實感染了USUV[5]，這是在歐洲發(fā)現(xiàn)的首例人感染USUV病例。1996年，意大利的佛羅倫薩和皮斯托亞兩個城市發(fā)現(xiàn)不明死因的鳥類，死亡鳥類中以烏鶇(Turdusmerula)為主要，意大利的獸醫(yī)雜志進行了報道[6]，但沒有得到廣泛的關注。直到2001年，對保存的組織樣品進行溯源檢測后證實是USUV[7]，這也是USUV通過鳥類傳入歐洲的最早證據(jù)之一。USUV病是地方流行性傳染病，發(fā)現(xiàn)于非洲大陸，目前主要在歐洲傳播流行，由于其為人獸共患病，從公共衛(wèi)生防控方面應考慮應引起一定的重視。本文嘗試對USUV的病原、宿主范圍、臨床癥狀、診斷及防控作一詳細介紹。

1 病毒的基因特性

根據(jù)基因序列分析，USU基因序列非常保守，目前有6個譜系，3個非洲譜系和3個歐洲譜系[7]。已有數(shù)據(jù)和文獻表明，非洲譜系基因的演變形成較復雜，歐洲譜系的主要在歐洲本土的易感動物和宿主之間循環(huán)傳播形成[7]。

2 宿主范圍

2.1蚊子 與黃病毒屬其它病毒一樣，蚊子是USUV傳播的中間宿主。1959年，南非最早報道在成年的雌性庫蚊中分離出USUV[2]。接著在非洲大陸的中非、布基納法索、尼日利亞和烏干達等國家的也相繼報道從蚊子分檢測USUV[4]，近來，在肯尼亞也報道發(fā)現(xiàn)蚊子攜帶USUV[8]。從發(fā)現(xiàn)USUV傳入歐洲后，歐洲各國對蚊子感染USUV水平的監(jiān)測也相繼展開。2006年，西班牙加泰羅尼亞地區(qū)通過監(jiān)測在尖音庫蚊(Culexpipiens)發(fā)現(xiàn)USUV[9]；2009年，在西班牙中部地區(qū)監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)(Culexperexiguus)攜帶USUV[10]。同年，意大利在國內(nèi)不同地區(qū)普查西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)和USUV時，在庫蚊(pipiens)和白紋伊蚊(Aedesalbopictus)中發(fā)現(xiàn)USUV[11]。2010年，德國通過監(jiān)測在庫蚊中發(fā)現(xiàn)USUV[12]，同年，捷克通過監(jiān)測發(fā)現(xiàn)兇小庫蚊(Culexmodestus)攜帶USUV[13]。隨著大家對USUV關注度的增加，以色列在2014-2015年監(jiān)測中，在尖音庫蚊(Culexpipiens)、(Culexperexigus)和白紋伊蚊(Aedesalbopictus)檢測出USUV[14]。通過分析攜帶USUV蚊子的種類發(fā)現(xiàn)，尖音庫蚊(Culexpipiens)在各國監(jiān)測中陽性率高[15]，為攜帶USUV的主要蚊子種類。

2.2鳥類 目前發(fā)現(xiàn)鳥類是USUV最主要宿主，USUV從非洲發(fā)現(xiàn)到目前主要在歐洲流行，可能的傳染源也指向鳥類，攜帶USUV的候鳥定期遷徙從而將病毒擴散。USUV最早起源于非洲，在2001年以前，沒有文獻記載非洲在鳥類中發(fā)現(xiàn)USUV。直到2008年，摩洛哥在鳥類血清調(diào)查中檢出USUV抗體[16]。2015年，突尼斯在鳥類血清學普查中發(fā)現(xiàn)棕斑鳩(Spilopeliasenegalensis)血液有USUV抗體[17]。近兩年未見報道非洲地區(qū)鳥類感染USUSV的文獻。

USUV目前在歐洲已成為鳥類的一種本土流行病。2001年，奧地利大量死亡的本地鳥類中分離出USUV[18]，這也是歐洲首次發(fā)現(xiàn)USUV，也是在非洲大陸外首次發(fā)現(xiàn)USUV。盡管后來，懷疑1996年意大利的佛羅倫薩和皮斯托亞兩個城市發(fā)現(xiàn)烏鶇為主要不明死因的鳥類感染USUV致死，并在保存的樣品檢測出USUV得到證實[6]。并且推論早在1996年以前USUV已經(jīng)傳入歐洲。從這以來，歐洲大陸各國陸續(xù)在鳥類中發(fā)現(xiàn)USUV。

2001年和2002年，英國在普查USUV時，在烏鴉、喜鵲和火雞血清中發(fā)現(xiàn)病毒中和抗體[19]，2004年對雞群的血清學普查時同樣發(fā)現(xiàn)USUV抗體[20]。

2003年至2006年之間，對奧地利和匈牙利52種322只死亡鳥只進行USUV感染情況調(diào)查，2003年和2004年的死亡鳥只沒有發(fā)現(xiàn)USUV，2005年只發(fā)現(xiàn)1只死亡的烏鶇核酸及免疫組化檢測都呈陽性[21-22]。監(jiān)測結(jié)果可推測烏鶇經(jīng)過病毒感染自身已有一定的抵抗力。

2002年至2005年，德國對87種侯島和本土鳥類共3 399份血清樣本監(jiān)測WNV和USUV抗體，發(fā)現(xiàn)1只白鸛(Ciconiaciconia)、1只紅尾鴝(Phoenicurusphoenicurus)和1只鶚(Pandionhaliaetus)血清USUV抗體呈陽性[23]。

2006年，在普查鳥類血清USUV抗體時，波蘭發(fā)現(xiàn)1只棕頭鷗(Larusridibundus)呈陽性[24]，捷克發(fā)現(xiàn)1只白冠雞(Fulicaatra)呈陽性[25]。同年，瑞士蘇黎世動物園發(fā)現(xiàn)鸮形目的烏鴉、雪鸮和貓頭鷹病死鳥中USUV核酸呈陽性[26]，并在接下來的3年持續(xù)監(jiān)測中均發(fā)現(xiàn)鳥類感染USUV。2006-2007年，對中歐國家的維也納、巴塞爾和蘇黎世地區(qū)動物園及布達佩地區(qū)捕獲的372只鳥只血清USUV抗體監(jiān)測中，陽性率分別為8.75%，6.59%，5.3%和0%，其中陽性率最高是雪鸮(Buboscandiaca)[27]。

2006-2008年夏季期間，學者在意大利北部監(jiān)測鳥類USUV流行情況，在2只烏鶇和3只雪鸮體內(nèi)檢出USUV核酸陽性[28]。2008-2009年，意大利北部地區(qū)每年對1000只野鳥監(jiān)測USUV抗體，分別檢出11份和12份陽性樣品[29]。在接著的2012-2013年的笑血清抗體監(jiān)測中，在47種鳥類的297份樣品中檢出4份USUV抗體陽性樣品[30]。

2011年6月開始，德國西南地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)大量的死亡鳥類，對死亡的86只6種鳥類進行檢測，18只烏鶇分離出USUV[31]，接下來的幾年，該地區(qū)也陸續(xù)在鳥類中檢測出USUV[32]。2011年1月至9月，塞爾維亞伏伊伏丁那(Vojvodina)省對鳥類感染W(wǎng)NV流行性普查，共收集92份鳥類血樣，對其中12血樣檢測USUV時，發(fā)現(xiàn)1份血樣中各抗體陽性[33]。2011年10月至2012年2月，西班牙南部加的斯(Cádiz)在獵鳥季對捕獲的159只紅腿鷓鴣(Alectorisrufa)和13只雉雞(Phasianuscolchicus)進行USUV中和抗體普查，陽性率分別為6.92%(11/159)和 63.64%(7/13)，結(jié)果表明雉雞感染高[34]。同樣在西班牙南部，2012年2月，2只出現(xiàn)神經(jīng)癥狀且被捕獲后短期死亡的候鳥歐歌鶇(Turdusphilomelos)均被檢測出USUV核酸陽性[35]。2011年，捷克布爾諾(Brno)在1只死亡的烏鶇體內(nèi)分離到USUV，1年后，同樣在布爾諾，2只死亡烏鶇又被分離出USUV[36]，2012年10月，比利時默斯谷(Meuse Valley)捕獲的1只3歲紅腹灰雀(Pyrrhula pyrrhula)和1只成年大斑啄木鳥(Dendrocopos major)被檢出USUV核酸陽性[37]。2012年10月-2013年4月，波蘭對16只鳥血清樣本監(jiān)測USUV中和抗體時，發(fā)現(xiàn)1例蒼鷹(Accipitergentilis)陽性[38]。

2014年，希臘學者發(fā)表一篇關于WNV在其國內(nèi)流行情況文章，于2010年-2011年通過兩次監(jiān)測家鴿中WNV血清抗體水平與人感染W(wǎng)NV相關性時，發(fā)現(xiàn)1份2010年11月17日采集的樣品USUV中和抗體陽性[39]。2015年，法國鳥類監(jiān)測網(wǎng)絡的2個點發(fā)現(xiàn)烏鶇死亡比平時高，一個是靠近德國的上萊菌(Haut-Rhin)附近，一個羅訥(Rh?ne)，通過檢測，在3只死亡烏鶇中分離出USUV[40]。

2016年3月，荷蘭在監(jiān)測鳥類蟲媒病毒時，發(fā)現(xiàn)在格爾德蘭(Gelderland)省瓦赫寧恩(Wageningen)采集2只烏鶇喉拭子USUV監(jiān)測結(jié)果為陽性，8月份至9月份，出現(xiàn)病癥及死亡的鳥類增多，陸續(xù)在烏鶇和烏林鸮(Strixnebulosa)體內(nèi)檢測出USUV核酸[41]。同年夏季，比利時、法國、德國和荷蘭針對出現(xiàn)USUV癥狀及死亡鳥類逐漸增多情況下，啟動USUV在鳥類流行情況調(diào)查，17只活鳥樣品和147只死亡鳥只被檢出USUV核酸陽性[42]。另外，德國國家野生鳥類監(jiān)測網(wǎng)絡在2016年收集100只死亡或瀕臨死亡野鳥組織樣本，73只被檢出USUV核酸陽性[43]。

目前，在歐洲10個國家的鳥類中發(fā)現(xiàn)USUV，見表1?？紤]USUV和WNV抗體的交叉反應，表1以病毒分離或檢出病毒核酸陽性作為診斷依據(jù)。非洲的摩洛哥、突尼斯、歐洲的波蘭和希臘雖然在鳥類血液中檢出USUV抗體陽性，但不在表1中列出。

2.3人 1981年，發(fā)現(xiàn)首例人類感染USUV病例，USUV在中非一個出現(xiàn)發(fā)熱和皮疹癥狀病人分離出來。2004年，一名布基納法索(非洲國家)男孩身上分離到USUV[4]，證實感染USUV。

表1 各國或地區(qū)鳥類首次感染USUV一覽表Tab.1 The first detection USUV among avian species in world

2009年，意大利報道在一名病人證實感染了USUV[5]，這是在歐洲發(fā)現(xiàn)的首例人感染USUV病例，該名60歲的女患者出現(xiàn)大腦功能受損的神經(jīng)癥狀，通過Vero E6細胞在病人血漿分離出USUV[44]。同年，一名接受過肝移植的意大利女性病人出現(xiàn)血栓性血小板減少性紫癜也被證實感染USUV。從這以后，直到2013年克羅地亞暴發(fā)西尼羅病毒病時期，在普查8月30日-9月7日采集樣品中檢測WNV和USUV時，從3名分別為29歲、56歲、61歲病人血液中檢測出USUV[45-46]。2012年，意大利博洛尼亞大學學者普查359份獻血者血樣時，發(fā)現(xiàn)4份血樣中IgG陽性[47]，陽性率對獻血者的跟蹤調(diào)查4個月，均未發(fā)現(xiàn)發(fā)熱癥狀。意大利博洛尼亞St Orsola-Malpighi大學醫(yī)院對中北部地區(qū)6 000份獻血者血液中檢出14份IgG陽性血樣[48]，結(jié)果表明USUV在人群中呈隱性感染。

為進一步了解USUV感染人的情況，意大利莫利塞人畜共患病研究所西尼羅病OIE參考實驗室對意大利泰拉莫地區(qū)2008-2011年出現(xiàn)就診患者保存的血液樣本進行追溯性普查，從306份脊髓液中檢出8份核酸陽性樣品；609份血樣中檢出2份核酸陽性樣品和40份中和抗體陽性樣品[49]，同樣證實USUV在人群中存在。

2012年，德國對1月份收集的4 200份捐獻的血樣進行USUVIgG和IgM抗體篩查，檢出1例抗體陽性[50]。德國在2016年6月1日-12月31日對13 023份捐獻的血樣普查WNV核酸時，9月26日的1例血樣呈陽性，接著對該獻血者進行跟蹤調(diào)查，在11月20日復查的血樣中檢出USUV核酸，證實該獻血者感染USUV[51]。

針對2016年法國、荷蘭、比利時和德國均發(fā)現(xiàn)較多鳥類感染USUV，法國在5月至11月進行了一項人群感染W(wǎng)NV和USUV與蚊子活躍期相關性普查。篩選性共抽取具有明顯神經(jīng)癥狀的666名患者脊髓液進行USUV篩查。2016年11月10日，在一名3 d前伴有突發(fā)性神經(jīng)癥狀的39歲男性患者的脊髓液中PCR檢測USUV核酸呈陽性反應，樣品接種非洲綠猴Vero細胞和原代人星形膠質(zhì)細胞也確診為陽性[52]。但該名患者的血樣樣品中PCR和抗體檢測均呈陰性，推測其感染USUV時間較短，病毒在血液中含量非常低，同時也未有足夠時間產(chǎn)生抗體。

2017年7月至8月，奧地利研究人員對這期間捐獻的12 047份血樣進行USUV普查，檢出6份USUV核酸陽性血樣，并且進行了序列譜系分析，均屬于歐洲2型USUV[53]。

自從USUV傳入歐洲地區(qū)以來，特別是在2009年發(fā)現(xiàn)人感染USUV病例后[5]，隨后的時間陸續(xù)發(fā)現(xiàn)人感染USUV病例，見表2。與USUV感染鳥類或蚊子攜帶USUV趨于同步，引起歐洲各國衛(wèi)生部門的高度重視，個別國家通過監(jiān)測獻血者樣品的來獲取人USUV感染數(shù)據(jù)，用于評估是否將USUV檢測納入捐獻血液的衛(wèi)生指標。

2.4其它動物 類似其它黃病毒，USUV還在其它動物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。2008年至2009年，意大利實施了一個馬、雞、野鳥和蚊子中WNV和USUV國家監(jiān)測項目，在馬的血清檢出USUV抗體，陽性率21.5%[54]。2009-2010年，塞爾維亞普查WNV在馬匹中流行情況時，檢出一份高滴度USUV中和抗體樣品[55]。2011年，克羅地亞在69份馬匹血樣中檢出2份陽性USUV中和抗體[56]。2011年至2012年，西班牙馬略卡島(Mallorca)對馬匹普查USUV血清抗體時，檢出1.2%的陽性率[57]。2012年，摩洛哥對軍馬和軍犬普查主要黃病毒流行情況時，發(fā)現(xiàn)馬匹血清中USUV抗體陽性率達60%，而軍犬的陽性更高達62%[58]，推測犬類也可感染USUV。同年，突尼斯對284份馬匹血清普查WNV和USUV抗體時，檢出10份USUV陽性抗體[59]。

表2 各國或地區(qū)人類感染USUV一覽表Tab.2 List of countries or regions with human infection of USUV

a. 樣品采集時間2009年6月至2009年10月，血液樣品數(shù)量359份；b. 樣品采集時間2010年9月1日至2011年6月30日，血液樣品數(shù)量6 000份；c. 樣品采集時間2012年1月，血液樣品數(shù)量4200份；d. 樣品采集時間2008年至2009年，脊髓液樣品數(shù)量306份；e. 樣品采集時間2008年至2011年，血液樣品數(shù)量609份；f. 樣品采集時間2016年至1月1日至12月31日，血液樣品數(shù)量13 023份；g. 樣品采集時間2016年11月至10月；h. 樣品采集時間2017年7月至8月，血液樣品數(shù)量12 047份

2011年至2012年，塞爾維亞在普查WNV在豬、野豬和狍動物中流行情況時，同時對部分樣品監(jiān)測USUV抗體，在4頭野豬血樣中檢出USUV抗體[60]。

2013年，德國在2只死亡的伏翼屬(Pipistrellus bats)蝙蝠組織中檢出USUV核酸，進一步測出全基因序列通過序列比較屬于歐洲3系USUV[61]。

2003年至2014年，西班牙對全國捕獲的4 963頭反芻獸類動物普查WNV和USUV流行情況，馬鹿(Cervus elaphus)、歐洲小鹿(Dama dama)、綿羊(Ovis aries musimon)和狍子(Capreolus capreolus)血清USUV抗體陽性率為0.1%～0.2%[62]。

3 易感細胞

豬腎細胞(PS)最先被證實可用于培養(yǎng)分離USUV的細胞，USUV可致PS細胞發(fā)生病變[63]。通過在人類(HeLa)、綠猴(Vero)、馬(ED)、牛(MDBK)、豬(PK-15)、兔(RK-13)、犬(MDCK, DK)、貓(CR)、倉鼠(BHK-21, BF)、老鼠(C6)和海龜(TH1)等親本細胞及馬腎原細胞(EqK)、鵝胚成纖維細胞(GEF)、雞胚成纖維細胞(CEF)的培養(yǎng)分離試驗表明，病毒在所有上述哺乳動物均可復制，但只有Vero 、PK-15和GEF3種細胞發(fā)生病變[64]。德國學者通過試驗證實堤岸田鼠(Myodes glareolus,Bank voles)腎細胞也可用于USUV的分離或增殖[65]。隨著人類對新出現(xiàn)黃病毒的研究，發(fā)現(xiàn)13種細胞系對USUV和寨卡病毒(Zika Virus)易感，包括Tb 1 Lu、 DF-1、Sf 1 Ep、 EA.hy.926、FoLu,、Pl 1 Ut、OHH1.K、OK、DN1.Tr、LLC-MK2、BT、WCH-17和Mv 1 Lu細胞系[66]。

另外，體外試驗顯示USUV對人神經(jīng)元、小神經(jīng)膠質(zhì)等神經(jīng)細胞和人神經(jīng)干細胞有明顯的致病性，表現(xiàn)出強烈的細胞毒性[67]。USUV可在不同動物細胞中培養(yǎng)分離，進一步揭示其感染傳播的范圍，即可在傳播媒介蚊子中存在，也可以在鳥類等脊椎動物中傳播，也可能存在哺乳動物中循環(huán)傳播。

4 臨床癥狀

目前，動物感染USUV后臨床癥狀的信息比較少。雀形目的鳥類感染USUV表現(xiàn)為沉郁、羽毛蓬亂、共濟失調(diào)，并急性死亡等癥狀[26]。因感染USUV死亡的鳥類解剖可見肝臟和脾臟出現(xiàn)中度充血腫大，在脾臟不同程度出現(xiàn)壞死病灶，組織病理切片進一步顯示肝臟有嚴重炎癥及壞死病灶；心臟和腎臟病理切片出現(xiàn)血管周圍有局部灶性淋巴組織細胞浸潤，心肌出現(xiàn)輕微炎癥[26,28]；有些病例出現(xiàn)輕度急性壞死性腎炎，灶性間質(zhì)淋巴組織細胞浸潤，腎小管上皮細胞散在壞死[7]。一些死亡鳥只腸道解剖有嚴重的急性卡他性腸炎[21]。腦部病理組織切片出現(xiàn)神經(jīng)元和浦肯野細胞壞死，膠質(zhì)變性[35]，腦部血管出現(xiàn)炎，血管內(nèi)外可見白細胞溶解[26]。

由于人感染USUV出現(xiàn)臨床癥狀的數(shù)量不多，在非洲感染的病人的主要表現(xiàn)為高熱、神經(jīng)癥狀，皮疹、黃疸[4]；在歐洲感染的病人臨床表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、頸強直和手顫等癥狀[44]，另外患者可能伴有腦膜炎[5]；法國最近發(fā)現(xiàn)的患者則出現(xiàn)四肢漸進性麻痹、面癱和眼瞼下垂等神經(jīng)癥狀[52]；在捐獻血液中檢出USUV的獻血者沒有癥狀，基本呈隱性感染狀態(tài)。

5 診 斷

病毒分離是最基本的診斷方法，豬腎細胞(PS)、Vero 、PK-15和GEF等細胞均可用于USUV分離培養(yǎng)[64]。由于USUV屬于黃病毒，且可感染人，對人有一定的致病能力，病毒分離對實驗生物安全要求高，且病毒分離試驗時間長和對設備要求高，只適合在確診實驗室開展。

病毒中和試驗和ELISA方法是發(fā)現(xiàn)人獸動物感染USUV病毒狀況的血清學檢測方法，但由于該病毒與其他黃病毒存在血清學交叉反應，因此在檢測時要注意排除與同屬其它黃病毒交叉反應的現(xiàn)象。一種通過重組NS1蛋白用于檢測血清中IgG抗體的ELISA試劑盒已商品化，適用于USUV的常規(guī)普查[68]。

PCR方法在USUV檢測診斷顯示快速和準確的特性，主要是根據(jù)病毒NS5基因的保守性設計研究。其中熒光定量RT-PCR方法在歐洲的鳥類開始流行時就建立[68]；RT-PCR方法目前在人血樣和細胞分離培養(yǎng)樣品中可檢測每個反應50個拷貝，相當于2 000個拷貝/mL濃度[69]；另外，已建立一步法的多重RT-PCR可同時鑒別WNV和USUV[70]。用于診斷USUV的PCR方法在普查和作為驗證方法方面顯示其快速的優(yōu)勢，但目前還沒有商品化的試劑盒。

從目前發(fā)現(xiàn)的USUV分析，基本都是在監(jiān)測多種黃病毒屬病毒時發(fā)現(xiàn)人類感染USUV。由于人類感染USUV時癥狀不明顯，往往會出現(xiàn)漏診的情況。建議在鳥類常發(fā)生感染USUV地區(qū)，在蚊子活躍時期，在做好蚊子中攜帶WNV、寨卡和USUV普查的同時，對該地區(qū)的發(fā)熱和出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的病人進行同時進行WNV、寨卡和USUV檢測，提高USUV的檢出率。

6 展 望

隨著USUV感染人類病例增多，近幾年逐步引起部分國家公共衛(wèi)生部門的重視。迄今仍沒有針對USUV疫苗研制的報道。但針對近年來出現(xiàn)的黃病毒屬如WNV和寨卡病毒等疫苗的研究目前正成為各國科學家研究的熱點。已有的成果顯示W(wǎng)NV的疫苗在成年白鼠體內(nèi)可誘導產(chǎn)生的低濃度的IgG抗體，可與USUV產(chǎn)生交叉反應。重組USUV膜蛋白(prM/M)和囊蛋白(E)也誘導產(chǎn)生抗USUV的中和抗體，可作為疫苗研究的一種候選方式[71]。

USUV屬于黃病毒，并且對人類有一定的致病力，可通過蚊子的叮咬隨意傳播，應該引起足夠的重視。特別是現(xiàn)在各國人流的頻繁流動，在疫源地的蚊子、鳥類、隱性感染動物或人群均可能傳播USUV。同時，應加強國境衛(wèi)生檢疫和動物檢疫，防止USUV的傳入和擴散。條件成熟的邊境口岸應制定USUV的監(jiān)測計劃，在條件允許情況下對從非洲或歐洲進境的鳥類進行抽樣監(jiān)測USUV，為進一步的風險評估及突發(fā)疫情提供真實、全面的數(shù)據(jù)。

收稿日期：2018-05-08編輯：張智芳