• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雷公藤多苷對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織MIF及TLR4的影響

    2018-12-04 10:28:20鐘繼紅徐磊鄭華君
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2018年22期
    關(guān)鍵詞:潰瘍性結(jié)腸炎

    鐘繼紅 徐磊 鄭華君

    [摘要] 目的 觀察雷公藤多苷對潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)小鼠結(jié)腸組織巨噬細胞游走抑制因子(MIF)和Toll樣受體4(Toll-like receptor,TLR4)的影響。 方法 按照隨機原則將BALB/c小鼠分為正常對照組、模型對照組和雷公藤多苷低、中、高劑量組。采用右旋葡聚糖硫酸鈉法(DSS)復(fù)制BALB/c小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。正常對照組小鼠自由飲水,其余各組小鼠每日灌胃給藥1次,連續(xù)7 d。模型對照組予生理鹽水0.4 mL灌胃,不同劑量雷公藤多苷組分別以9.00、27.03和81.09 mg/kg濃度的雷公藤多苷混懸液0.40 mL灌胃,實驗期間每天觀察小鼠一般情況,末次給藥后解剖觀察,組織切片染色,光鏡下觀察結(jié)腸組織的病理學變化,采用ELISA酶聯(lián)法檢測結(jié)腸組織勻漿蛋白MIF的含量,以熒光定量PCR檢測結(jié)腸黏膜TLR4 mRNA表達。 結(jié)果 模型對照組小鼠結(jié)腸組織中MIF含量和TLR4 mRNA水平較正常對照組明顯上升,而不同劑量雷公藤多苷組小鼠結(jié)腸組織中MIF含量較模型對照組明顯下降(P<0.01),TLR4 mRNA表達顯著降低(P<0.01)。 結(jié)論 雷公藤多苷通過降低MIF含量,進而降低TLR4 mRNA表達,影響TLR4信號通路,從而達到抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的作用。

    [關(guān)鍵詞] 雷公藤多苷;潰瘍性結(jié)腸炎;巨噬細胞游走抑制因子;Toll樣受體4

    [中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2018)22-0032-04

    [Abstract] Objective To observe the effects of Tripterygium glycosides on the migration of macrophage migration inhibitory factor(MIF) and toll-like receptor 4(TLR4) in colonic tissue of mice with ulcerative colitis. Methods BALB/c mice were randomly divided into normal control group, model control group and low, medium and high doses of Tripterygium glycosides groups. Ulcerative colitis model of BALB/c mice was replicated by dextran sodium sulfate method (DSS). The normal control group had free access to water, the remaining groups were administered intragastrically once a day for 7 days. The model control group was given normal saline 0.40 mL through intragastric administration. Different dose groups were given 0.4 mL of 9.00, 27.03 and 81.09 mg/kg tripterygium glycosides suspension through intragastric administration. General status of mice were observed daily during the experiment. After the last administration, we conducted anatomical observation and histological section staining to colonic tissue, and pathological changes of colonic tissue were observed under light microscope. The contents of MIF in colonic tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), and the expression of TLR4 mRNA in colonic mucosa was detected by fluorogenic quantitative PCR. Results MIF and TLR4 mRNA level in colonic tissues of model control group were significantly increased compared with those of normal control group. MIF levels in colonic tissues of different doses of tripterygium glycosides group were significantly lower than those of model control group(P<0.01), and TLR4 mRNA expression was significantly reduced (P<0.01). Conclusion Tripterygium glycosides can reduce MIF level, and then inhibit the expression of TLR4 mRNA and TLR4 signaling pathway, thereby achieving the effect of anti-ulcerative colitis.

    [Key words] Tripterygium glycosides;Ulcerative colitis;Macrophage migration inhibitory factor; Toll-like receptor 4

    UC是一種累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層的慢性反復(fù)發(fā)作性炎癥疾病,臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,發(fā)病率逐年上升,預(yù)后較差。UC的發(fā)病機制中,腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)功能紊亂,進而導(dǎo)致的局部持續(xù)性感染和炎癥損傷被認為是重要環(huán)節(jié)[1],而巨噬細胞移動抑制因子(MIF)和Toll樣受體4(TLR4)在其中起重要作用[2,3]。既往的研究證實,UC發(fā)病的機制可能通過激活MIF進一步激活TLR4信號通路進一步引起炎癥反應(yīng):細菌LPS等胞外致炎信號刺激巨噬細胞高水平表達MIF,MIF上調(diào)TLR4 mRNA的表達,經(jīng)MyD88分別激活NF-κB、p38 MAPK和JNK信號通路,上調(diào)IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8,IL-17等促炎因子的表達,從而導(dǎo)致UC的發(fā)病[4-6]。雷公藤多苷提取自中藥雷公藤,具有免疫調(diào)節(jié)作用,常用于治療免疫系統(tǒng)疾病,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、UC等,療效肯定[7,8],但其作用機制及作用靶點尚不明確,本實驗擬從其對UC小鼠結(jié)腸黏膜MIF和TLR4 mRNA的影響上闡明其部分作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    健康♂SPF級BALB/c小鼠50只,體質(zhì)量(20±2)g,由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(浙)2013-0184。

    1.2 實驗試劑與藥物

    DSS( Fluka:5000MW,31404)購自Sigma公司;MIF 試劑(ELISA)購于上海西唐生物科技有限公司,批號1102261;雷公藤多苷片(10 mg/片),由浙江得恩德制藥有限公司生產(chǎn),批號z33020422。

    1.3 實驗分組及造模

    所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始于實驗,隨機分為5組,每組10只,分別為正常對照組、模型對照組、雷公藤多苷低、中、高不同劑量組。參考文獻[9]中的DSS造模方法制備慢性結(jié)腸炎模型,方法如下:除正常對照組外的小鼠自由飲用5%DSS溶液1周,然后每天觀察小鼠的生活狀態(tài)及大便情況。以大便帶血或大便次數(shù)增多或稀便或體重減輕視為造模成功。第8天隨機處死各組小鼠1只,剖腹取結(jié)腸,清洗后肉眼觀察結(jié)腸充血水腫情況,并取8 cm直乙交界處腸段(甲醛固定)做組織切片,以確定造模成功。

    1.4 藥物混懸液配制及處理

    按人-小鼠體表面積換算,分別用蒸餾水配制成低、中、高不同劑量雷公藤多苷混懸液(9.00、27.03和81.09 mg/kg)。然后每天不同劑量組各取0.40 mL混懸液分別對每只小鼠灌胃,正常對照組及模型對照組均以0.40 mL生理鹽水灌胃,每天1次,連續(xù)7 d。

    1.5 一般情況觀察

    自造模開始每日觀察各組小鼠的精神狀態(tài),活動度,進食飲水情況等。稱取各組小鼠的體質(zhì)量,記錄各組小鼠的大便情況,包括次數(shù)、形狀和出血情況等。

    1.6 結(jié)腸組織采集和病理學觀察

    治療給藥結(jié)束后,正常對照組小鼠直接采用頸部脫臼法處死,而其他4組小鼠皮下注射脂多糖(LPS),24 h后處死。取出結(jié)腸組織,沖洗干凈后觀察各組小鼠距肛8 cm結(jié)腸組織的大體改變,其中一部分結(jié)腸組織以10%中性甲醛溶液固定以備用,另一部分結(jié)腸組織用于制備組織勻漿,儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.7 MIF含量檢測

    取部分備用結(jié)腸組織稱重,進行超聲勻漿,取上清液0.1 mL,按ELISA試劑盒說明書檢測MIF的濃度。

    1.8 TLR4表達水平檢測

    結(jié)腸組織總RNA按Trizol法提取,具體參照RT試劑盒說明的步驟。

    1.9 統(tǒng)計學方法

    應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件,計量資料以(x±s)表示,兩兩比較采用LSD-t檢驗及Dunnett-t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 一般情況

    模型對照組小鼠出現(xiàn)活動減少,反應(yīng)遲鈍,豎毛,毛色失去光澤,凌亂,大便不成形,夾有血便及黏液便,次數(shù)增多,體質(zhì)量減輕。低、中、高劑量雷公藤多苷組的上述癥狀較模型對照組減輕。正常對照組小鼠活潑,體質(zhì)量、毛色、胃口及大便均正常。

    2.2 各組小鼠結(jié)腸組織病理學改變

    模型對照組:鏡下可見小鼠結(jié)腸組織明顯充血水腫,見破碎的細胞和腺體,層次不清,另見大量中性粒細胞細胞浸潤,黏膜淺潰瘍形成;低劑量雷公藤多苷組:鏡下可見結(jié)腸組織水腫仍較明顯,大量炎性細胞浸潤,黏膜仍有散在淺潰瘍;中劑量及高劑量雷公藤多苷組:鏡下可見結(jié)腸組織水腫和充血基本消失,炎性細胞浸潤明顯減少,另可見已愈合的潰瘍組織;正常對照組:光鏡下可見結(jié)腸黏膜光滑完整,腺體清晰、層次清楚,未見中性粒細胞等炎性細胞浸潤等(封三圖4)。

    2.3 各組小鼠結(jié)腸組織的MIF含量

    正常對照組小鼠結(jié)腸組織中MIF含量均低于模型組和不同劑量雷公藤多苷組(P<0.01),模型對照組高于不同劑量雷公藤多苷組,而不同劑量雷公藤多苷組中,低劑量組高于中劑量組,高于高劑量組。見表1。

    2.4 各組小鼠結(jié)腸組織TLR4 mRNA的表達水平

    TLR4 mRNA表達水平在模型對照組和不同劑量雷公藤多苷組較正常對照組均有不同程度的升高,且不同劑量雷公藤多苷組的TLR4 mRNA表達水平較模型對照組顯著降低(P<0.01),但中劑量雷公藤多苷組與高劑量雷公藤多苷組與正常對照組TLR4 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

    3 討論

    潰瘍性結(jié)腸炎病因病機尚不明確,好發(fā)于年輕人,病程慢性遷延,反復(fù)發(fā)作,臨床治愈率低,給社會生產(chǎn)力和個人生活質(zhì)量帶來極大影響[10]。當前臨床上常用水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑治療UC,但在UC緩解期治療時,藥物的可選擇性小,同時存在不良反應(yīng)多,難以堅持用藥,經(jīng)濟負擔重等缺點,造成患者的依從性低,從而引起疾病的復(fù)發(fā)。傳統(tǒng)中醫(yī)學認為UC屬于“痢疾”、“泄瀉”、“腸風”、“下利”等范疇,其基本病機是脾虛濕盛,健脾化濕為其治療大法。中藥在長期維持治療中有不良反應(yīng)少、經(jīng)濟壓力小等優(yōu)勢。雷公藤多苷是從中藥雷公藤中提取出來的有效成分,具有抑制免疫的作用。劉端勇等[11]研究發(fā)現(xiàn):對于慢性炎癥性腸病模型小鼠采用雷公藤多苷治療有較好的療效,但確切的機制尚不清楚。鐘繼紅等[12]研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷可通過TLR4信號通路作用于UC模型小鼠,但具體的作用靶點有必要進一步深入,從而為下一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    MIF是一種具有多種生物功能的前炎癥因子,最初發(fā)現(xiàn)是在活化的T淋巴細胞中,故T淋巴細胞是MIF的重要來源之一。大量報道顯示在UC的發(fā)病過程中,MIF發(fā)揮了重要的作用,其主要抑制巨噬細胞的游走,促使活化免疫細胞和巨噬細胞分泌多種炎癥因子,參與免疫與炎癥疾病的進展[13]。王柏濤等[14]研究發(fā)現(xiàn),使用抗MIF單抗的UC小鼠與UC模型組小鼠比較,小鼠的糞便性狀、體重減輕幅度、結(jié)腸的大體表現(xiàn)及光鏡下黏膜改變等均有顯著改善,應(yīng)用免疫組化染色法觀察 MIF、TNF-α、IL-6等促炎因子,發(fā)現(xiàn)其表達也不同程度的下降,進一步證明抗MIF單抗對小鼠UC的發(fā)病的確能起到保護作用。易文等[15]研究發(fā)現(xiàn),UC模型小鼠結(jié)腸組織中 MIF表達顯著升高,而光鏡下發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏膜層變薄,黏膜下層局部充血水腫、伴有大量炎細胞浸潤,淋巴細胞散在分布。采用中藥經(jīng)方四逆散治療后能顯著改善上述異常變化。唐光耀等[16]實驗發(fā)現(xiàn):抗MIF單抗能有效地減輕DSS誘導(dǎo)的急性UC小鼠的外在表現(xiàn)及結(jié)腸大體及組織的損傷,有一定的治療作用,對UC小鼠有一定的保護作用,從側(cè)面顯示了MIF在UC致病中的作用。

    TLRs是啟動炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答的重要模式識別受體 ,通過快速而準確的感知及識別機體“自我”及“非我”的保守分子模式PAMPS以激活天然免疫系統(tǒng),同時作為預(yù)警信號,向抗原遞呈細胞(antigen presentcen,APC)發(fā)出警報,從而激活T細胞而啟動獲得性免疫系統(tǒng)[17]。LPS/TLR4在機體免疫反應(yīng)中的重要作用得到眾多學者的公認,近來TLR4也被認為是腸道免疫反應(yīng)的一類關(guān)鍵介質(zhì),TLR4 mRNA在正常的結(jié)腸黏膜中呈現(xiàn)低表達,而在UC的結(jié)腸黏膜中則呈現(xiàn)異常的高表達[18-19]。趙承滿等[20]證實烏司他丁能減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道炎癥反應(yīng),其機制可能與通過下調(diào)TLR4 mRNA及NF-κB的表達,減少炎癥因子TNF-α的釋放有關(guān)。

    本研究成功復(fù)制了小鼠慢性結(jié)腸炎的模型,該模型廣泛應(yīng)用于UC免疫病理機制的研究,同時用于評估新藥的療效。該模型小鼠結(jié)腸主要表現(xiàn)為黏膜廣泛充血水腫糜爛,腺體紊亂,層次不清,淺潰瘍形成,同時伴有中性粒細胞和淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤,符合人類潰瘍性結(jié)腸炎的病理改變。本研究結(jié)果表明:雷公藤多苷能有效治療DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥,主要表現(xiàn)在治療組小鼠結(jié)腸組織中MIF和TLR4 mRNA表達水平顯著降低,與模型對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),從研究結(jié)果可以得出結(jié)論:雷公藤多苷抑制結(jié)腸組織中MIF和TLR4 mRNA的表達可能是其治療UC的作用靶點。

    [參考文獻]

    [1] Hanauer SB.Inflammatory bowel disease:Epidemiology,pathogenesis and therapeutic opportunities[J].Inflamm Bowel Dis,2006,12(1):S3-9.

    [2] Grieb G,Merk M,Bernhagen J,et al.Macrophage migration inhibitory factor(MIF):A promising biomarker[J].Drug News Perspect,2010,23(4):257-264.

    [3] Soares JB,Pimentel Nunes P,Roncon Albuquerque R,et al.The role of lipopolysaccharide/toll-like receptor 4 signaling in chronic liver diseases[J].Hepatol Int,2010,4(4):659-672.

    [4] Ip YT,Davis RJ.Signal transduction by the C-Jun-N-Terminal Kinase(JNK) from inflammation to development[J].Curr Opin Cell Biol,1998,10:205-219.

    [5] Zhang DY,Chen LL,Li SL,et al. Lipopolysaccharide(LPS)of porphyromonas gingivalis induces IL-1B,NF-A and IL-6 production by THP-1 cells in a way different from that of escherichia coli LPS[J]. Innate Immun,2008, 14(1):99-107.

    [6] Dai JN,Zong Y,Zhong LM,et al. Gastrodin inhibits expression of inducible no synthase,Cyclooxygenase-2 and proinflammatory cytokines in cultured Lps-stimulated microglia via mapk pathways[J]. PLoS One,2011,6:e21891.

    [7] 王坤明,來旭華,鄭偉明,等.雷公藤多甙治療潰瘍性結(jié)腸炎臨床研究[J].實用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2005,19(4):336.

    [8] 馮勝剛. 雷公藤多甙對細胞免疫和臨床腎臟病免疫的影響[J].西部醫(yī)學,2003,1(4):367.

    [9] Stevceva L,Pavli P,Husband AJ,et al. The inflammatory infiltrate in the acute stage of the dextran sulphate sodium induced colitis:B cell response differs depending on the percentage of DSS used to induce it[J]. BMC Clin Pathol,2001,1:3.

    [10] 中華醫(yī)學會消化病分會炎癥性腸病協(xié)作組.中國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見[J].中華內(nèi)科雜志,2008,40(1):73-79.

    [11] 劉端勇,趙海梅,程紹民,等. 雷公藤多苷對結(jié)腸炎小鼠外周血CD40/CD40L表達的影響[J].中藥藥理與臨床,2012,28(1):94-97.

    [12] 鐘繼紅,王章流,劉英超,等.雷公藤多苷對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜TLR4信號通路表達的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2015,23(5):307-310.

    [13] Lue H,Kleemann R,Calandra T,et al. Macrophage migration inhibitory factor(MIF):Mechanisms of action and role in disease[J].Microbes Infect,2002,4(4):449-460.

    [14] 王柏濤,張啟芳,邱小芬,等.抗巨噬細胞移動抑制因子單抗對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠發(fā)病的干預(yù)機制研究[J].安徽醫(yī)科大學學報,2016,51(1):31-35.

    [15] 易文,覃慧林,石孟瓊,等.四逆散對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠 NF-κB 激活及MIF和細胞因子表達的影響[J].中藥材,2015,38(7):1476-1480.

    [16] 唐光耀,張啟芳,王柏濤,等.抗巨噬細胞移動抑制因子單抗對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸 NF-κB、IκB表達的影響[J].微創(chuàng)醫(yī)學,2017,12(2):170-174.

    [17] Takeda K,Kaisho T,Akira S. Toll-Like Receptors[J]. Annu Rev Immunol,2003,21:335-376.

    [18] Miyake K.Innate recognition of lipopolysaccharide by Toll-Like Receptor 4-Md-2[J].Trends Mierobiol,2004, 12:186-192.

    [19] Kumar H,Kawai T,Akira S.Toll-like receptor sand inflate immunity[J]. Biochem BioPhys ResCommun,2009,388:621-625.

    [20] 趙承滿,孟立娜,陳錦龍,等.烏司他丁對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸炎癥及TLR4/NF-κB信號通路的影響[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學,2017,34(3):347-351.

    (收稿日期:2018-03-22)

    猜你喜歡
    潰瘍性結(jié)腸炎
    潰瘍性結(jié)腸炎的中醫(yī)病因病機研究進展
    中西醫(yī)結(jié)合三重免疫療法治療潰瘍性結(jié)腸炎100例臨床療效分析
    研究美沙拉嗪與柳氮磺吡啶治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床有效性
    健康教育在潰瘍性結(jié)腸炎患者護理中的效果
    美沙拉嗪口服聯(lián)合保留灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎的效果
    腸炎清對ICUC大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF—κB蛋白表達、TLR4mRNA的影響
    藥物灌腸前行清潔灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎的護理觀察
    美沙拉嗪聯(lián)合雙歧三聯(lián)活菌治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床效果
    血清抗體檢測在炎癥性腸病中的臨床應(yīng)用研究
    血清C反應(yīng)蛋白和D—二聚體聯(lián)合檢測在潰瘍性結(jié)腸炎病情活動性判斷中的價值
    欧美日韩在线观看h| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产日韩欧美视频二区| 我要看日韩黄色一级片| 日本黄色日本黄色录像| 少妇精品久久久久久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久6这里有精品| 99热国产这里只有精品6| 性高湖久久久久久久久免费观看| 色视频www国产| 丰满乱子伦码专区| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 久久婷婷青草| videos熟女内射| 久久精品久久久久久久性| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产男人的电影天堂91| 日韩av在线免费看完整版不卡| 成人免费观看视频高清| 男女无遮挡免费网站观看| 91精品国产九色| 国产老妇伦熟女老妇高清| 美女福利国产在线| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲伊人久久精品综合| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲天堂av无毛| 国产伦精品一区二区三区视频9| 最新中文字幕久久久久| 国产成人91sexporn| 亚洲av福利一区| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲内射少妇av| 青春草亚洲视频在线观看| 成人特级av手机在线观看| 成人影院久久| 国产精品女同一区二区软件| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产黄片视频在线免费观看| 黄色毛片三级朝国网站 | 高清欧美精品videossex| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 性色avwww在线观看| 大片免费播放器 马上看| 午夜福利视频精品| 亚洲色图综合在线观看| 精品午夜福利在线看| 精品久久久久久电影网| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 精品国产乱码久久久久久小说| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产免费福利视频在线观看| 看十八女毛片水多多多| 亚洲中文av在线| 国产成人freesex在线| 亚洲无线观看免费| 久久久久久久久久成人| 国产精品不卡视频一区二区| 熟女av电影| 看免费成人av毛片| 五月开心婷婷网| 欧美激情国产日韩精品一区| 精品酒店卫生间| 亚洲av二区三区四区| 久久人妻熟女aⅴ| 免费av不卡在线播放| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲av二区三区四区| 岛国毛片在线播放| av福利片在线观看| 女人久久www免费人成看片| 高清视频免费观看一区二区| 国产毛片在线视频| 国产av一区二区精品久久| 亚洲第一av免费看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产av一区二区精品久久| 91精品一卡2卡3卡4卡| 日韩成人伦理影院| 另类亚洲欧美激情| 97超碰精品成人国产| 国产精品不卡视频一区二区| kizo精华| 精品少妇黑人巨大在线播放| 麻豆成人av视频| 看免费成人av毛片| 久久女婷五月综合色啪小说| 高清午夜精品一区二区三区| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久99精品国语久久久| 26uuu在线亚洲综合色| 26uuu在线亚洲综合色| 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日本午夜av视频| 精华霜和精华液先用哪个| 少妇丰满av| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 成人亚洲欧美一区二区av| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 91久久精品电影网| 久久久久久久久久久久大奶| 日韩欧美 国产精品| 国产精品一区二区性色av| 男女啪啪激烈高潮av片| 男人舔奶头视频| 日本色播在线视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成人国产av品久久久| 久久久午夜欧美精品| 一区二区三区精品91| 69精品国产乱码久久久| 日韩大片免费观看网站| 美女国产视频在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 免费av中文字幕在线| 一级毛片久久久久久久久女| av天堂久久9| 国产成人a∨麻豆精品| 一本久久精品| 最近手机中文字幕大全| 黄色视频在线播放观看不卡| 日韩一区二区三区影片| 如何舔出高潮| 一级av片app| 国产精品蜜桃在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 在线观看人妻少妇| videos熟女内射| 久久这里有精品视频免费| 免费看光身美女| 插逼视频在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 一级,二级,三级黄色视频| 街头女战士在线观看网站| 亚洲国产av新网站| 一本色道久久久久久精品综合| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 色哟哟·www| 国产综合精华液| 久久 成人 亚洲| 大片免费播放器 马上看| 精品久久久精品久久久| 国产 精品1| 少妇 在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| h视频一区二区三区| 国产欧美亚洲国产| 欧美xxⅹ黑人| 久久热精品热| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久精品国产自在天天线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产一区二区在线观看av| 2018国产大陆天天弄谢| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲成人手机| 夜夜骑夜夜射夜夜干| av国产久精品久网站免费入址| 久久99热这里只频精品6学生| 日韩强制内射视频| 黑人猛操日本美女一级片| 综合色丁香网| 好男人视频免费观看在线| 我要看黄色一级片免费的| 欧美精品亚洲一区二区| 午夜精品国产一区二区电影| 一级毛片aaaaaa免费看小| 两个人免费观看高清视频 | 久久精品国产自在天天线| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品女同一区二区软件| 嫩草影院新地址| 亚洲成人手机| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久久久精品性色| 纯流量卡能插随身wifi吗| tube8黄色片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品成人在线| 日韩三级伦理在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 热re99久久国产66热| 成年人午夜在线观看视频| 久热久热在线精品观看| 日韩视频在线欧美| 久久鲁丝午夜福利片| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久精品国产自在天天线| 国产男人的电影天堂91| 亚洲av免费高清在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 又黄又爽又刺激的免费视频.| av视频免费观看在线观看| 精品酒店卫生间| 亚洲无线观看免费| 免费观看av网站的网址| 一区二区三区精品91| av免费在线看不卡| 久久国产亚洲av麻豆专区| 麻豆成人午夜福利视频| 丝袜脚勾引网站| 亚洲不卡免费看| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久狼人影院| 亚洲精品一二三| 免费观看av网站的网址| 久久国产乱子免费精品| 在线观看三级黄色| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲欧美清纯卡通| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲人成网站在线播| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 精品少妇黑人巨大在线播放| av.在线天堂| 街头女战士在线观看网站| 七月丁香在线播放| 一级毛片电影观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产成人免费观看mmmm| av免费在线看不卡| 欧美性感艳星| av不卡在线播放| 性色av一级| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产高清不卡午夜福利| 国产黄色免费在线视频| 日韩大片免费观看网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 99热全是精品| 精品久久久噜噜| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产成人精品久久久久久| 男女边摸边吃奶| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 一级毛片久久久久久久久女| 一二三四中文在线观看免费高清| 曰老女人黄片| 伊人久久国产一区二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 女性生殖器流出的白浆| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | h视频一区二区三区| 亚洲性久久影院| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 永久网站在线| 国产一区二区在线观看日韩| av又黄又爽大尺度在线免费看| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产片特级美女逼逼视频| 国产爽快片一区二区三区| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产在线视频一区二区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 七月丁香在线播放| 精品少妇久久久久久888优播| 97精品久久久久久久久久精品| 一级爰片在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 精品少妇内射三级| 久热久热在线精品观看| 亚洲性久久影院| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 插阴视频在线观看视频| 久久久久久久久久久丰满| 国产欧美亚洲国产| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 曰老女人黄片| 高清在线视频一区二区三区| av有码第一页| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 精品久久久久久久久av| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 日本av免费视频播放| 男女国产视频网站| 男人狂女人下面高潮的视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 最新中文字幕久久久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产69精品久久久久777片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 春色校园在线视频观看| 国产亚洲一区二区精品| 人人妻人人看人人澡| av网站免费在线观看视频| 日韩三级伦理在线观看| 99久国产av精品国产电影| 日本欧美视频一区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲综合色惰| 99久久精品国产国产毛片| 成年女人在线观看亚洲视频| 日韩人妻高清精品专区| 青春草亚洲视频在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产精品99久久久久久久久| 日本与韩国留学比较| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产高清国产精品国产三级| 三级国产精品片| 色5月婷婷丁香| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产伦在线观看视频一区| 一区在线观看完整版| av国产精品久久久久影院| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品一区二区在线观看99| www.色视频.com| 久久国内精品自在自线图片| 少妇精品久久久久久久| 看十八女毛片水多多多| 免费人妻精品一区二区三区视频| xxx大片免费视频| 亚州av有码| 国产在视频线精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久久欧美国产精品| 国产精品福利在线免费观看| 五月玫瑰六月丁香| 精品一区在线观看国产| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久99热6这里只有精品| 欧美激情国产日韩精品一区| av.在线天堂| 婷婷色综合大香蕉| 在线观看美女被高潮喷水网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 丝袜在线中文字幕| 国产一级毛片在线| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美最新免费一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 国产av国产精品国产| 极品教师在线视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产精品偷伦视频观看了| 久久6这里有精品| 少妇熟女欧美另类| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品一区二区在线观看99| 免费观看a级毛片全部| √禁漫天堂资源中文www| 丰满少妇做爰视频| 一级av片app| 国产av一区二区精品久久| 日韩欧美 国产精品| 人人澡人人妻人| 51国产日韩欧美| 久久这里有精品视频免费| 美女国产视频在线观看| 五月天丁香电影| 欧美激情国产日韩精品一区| 成人毛片60女人毛片免费| 精品久久国产蜜桃| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲精品一二三| 美女大奶头黄色视频| 亚洲内射少妇av| 人妻人人澡人人爽人人| 成人综合一区亚洲| 99视频精品全部免费 在线| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产片特级美女逼逼视频| 国产乱人偷精品视频| .国产精品久久| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲av男天堂| 91久久精品国产一区二区成人| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品熟女少妇av免费看| 日本wwww免费看| 国产亚洲最大av| 特大巨黑吊av在线直播| 久久久久久久久久久免费av| 9色porny在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产69精品久久久久777片| 人妻 亚洲 视频| 在线看a的网站| 欧美bdsm另类| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 三级国产精品片| 99热这里只有是精品50| 伊人久久精品亚洲午夜| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 五月玫瑰六月丁香| 国产免费一区二区三区四区乱码| 99热这里只有是精品在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 永久网站在线| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 日本与韩国留学比较| 校园人妻丝袜中文字幕| 曰老女人黄片| kizo精华| 最近最新中文字幕免费大全7| av卡一久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产黄片视频在线免费观看| 女性被躁到高潮视频| 亚洲性久久影院| 五月玫瑰六月丁香| 2021少妇久久久久久久久久久| 新久久久久国产一级毛片| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 少妇的逼水好多| 成人毛片a级毛片在线播放| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产精品99久久久久久久久| 伊人亚洲综合成人网| 国产精品久久久久久av不卡| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲av日韩在线播放| 国产视频首页在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 热re99久久精品国产66热6| 97超碰精品成人国产| 国产永久视频网站| 夫妻午夜视频| 国产深夜福利视频在线观看| 尾随美女入室| freevideosex欧美| 国产av国产精品国产| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产av一区二区精品久久| 这个男人来自地球电影免费观看 | 99久国产av精品国产电影| 日韩一区二区视频免费看| 两个人的视频大全免费| 97超视频在线观看视频| 久久人人爽人人片av| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲欧美精品专区久久| 麻豆成人午夜福利视频| av视频免费观看在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 伦理电影免费视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产av国产精品国产| 三级国产精品片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| xxx大片免费视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | a级毛片免费高清观看在线播放| 久久久久国产精品人妻一区二区| av福利片在线观看| 在线观看三级黄色| 人妻系列 视频| 全区人妻精品视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 免费黄网站久久成人精品| 波野结衣二区三区在线| 国产视频首页在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| av在线播放精品| 久久亚洲国产成人精品v| 国产亚洲91精品色在线| 丁香六月天网| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成人免费无遮挡视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 女人精品久久久久毛片| 亚洲av综合色区一区| av网站免费在线观看视频| av一本久久久久| 国产一级毛片在线| 亚洲欧美精品专区久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲美女搞黄在线观看| 69精品国产乱码久久久| 免费观看的影片在线观看| 国产探花极品一区二区| 成人国产av品久久久| 国产亚洲精品久久久com| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 美女大奶头黄色视频| 国产成人精品婷婷| 99久国产av精品国产电影| 精品一品国产午夜福利视频| av播播在线观看一区| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品国产av在线观看| 免费观看a级毛片全部| 国产一级毛片在线| 永久网站在线| √禁漫天堂资源中文www| av在线老鸭窝| 日韩欧美 国产精品| 天美传媒精品一区二区| 一个人免费看片子| 婷婷色综合大香蕉| 99久国产av精品国产电影| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 日本欧美视频一区| a级毛片在线看网站| 美女中出高潮动态图| 免费人妻精品一区二区三区视频| 观看美女的网站| 涩涩av久久男人的天堂| 天堂中文最新版在线下载| 久久人人爽人人爽人人片va| 免费在线观看成人毛片| 不卡视频在线观看欧美| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产免费一区二区三区四区乱码| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品.久久久| 我的女老师完整版在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 精品熟女少妇av免费看| 18禁在线播放成人免费| 91精品一卡2卡3卡4卡| 日韩中字成人| 亚洲av不卡在线观看| 国产 一区精品| 老司机影院成人| 插逼视频在线观看| 久久影院123| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| av福利片在线| 日韩亚洲欧美综合| 国产伦在线观看视频一区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 亚洲色图综合在线观看| av在线app专区| 国产精品国产三级专区第一集| 一区二区三区乱码不卡18| av专区在线播放| 成人特级av手机在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美性感艳星| 99热6这里只有精品| 岛国毛片在线播放| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 妹子高潮喷水视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 三级国产精品片| 亚洲精品日韩av片在线观看| av在线播放精品| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久久午夜欧美精品| 亚洲自偷自拍三级| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产探花极品一区二区| 亚洲国产欧美在线一区| 嘟嘟电影网在线观看| 免费观看av网站的网址| 天堂8中文在线网| 国产色爽女视频免费观看| 国产黄频视频在线观看| 国产在视频线精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 成人国产麻豆网| 韩国av在线不卡| 99re6热这里在线精品视频| 一级毛片久久久久久久久女| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲天堂av无毛| 五月天丁香电影| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 91精品国产国语对白视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 日本wwww免费看| 美女内射精品一级片tv| 日本欧美视频一区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 黄色毛片三级朝国网站 |