不同生存期食管鱗癌患者載脂蛋白D表達(dá)水平的研究*

李曉靜 孫妞妞 李秀敏

食管癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［1］，預(yù)后較差，目前研究顯示中晚期食管癌患者的5年生存率約為15%［2］，甚至有的患者可長(zhǎng)期帶瘤生存［3］。闡明其分子機(jī)制能夠?yàn)樘綄な彻馨┬碌闹委煱悬c(diǎn)奠定分子基礎(chǔ)，也可為臨床上預(yù)測(cè)生存風(fēng)險(xiǎn)、實(shí)施個(gè)體化治療提供依據(jù)。本研究主要應(yīng)用絕對(duì)定量法（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸離子化串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF/TOF MS）技術(shù)，對(duì)不同生存期食管癌患者的差異蛋白進(jìn)行對(duì)比分析，獲得與食管癌生存期相關(guān)的血清關(guān)鍵候選蛋白，并進(jìn)一步驗(yàn)證，探討其能否成為預(yù)測(cè)食管癌患者預(yù)后的一種生物標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2008年3月至2009年9月河南省食管癌高發(fā)地區(qū)安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診食管鱗狀細(xì)胞癌并行根治性切除食管癌的患者731例，收集其一般資料（包括流行病學(xué)資料、疾病治療情況、生活習(xí)慣、手術(shù)時(shí)間、病理診斷、TNM分期、腫瘤大體類型、腫瘤大小、腫瘤部位、分化程度等資料）建檔作為資料庫(kù)，收集其術(shù)前血清標(biāo)本，并于術(shù)中選取癌組織標(biāo)本、正常食管黏膜（距手術(shù)切緣10 cm）。隨機(jī)從資料庫(kù)抽取生存期≤3年和生存期≥5年的患者各34例作為研究對(duì)象，其中男45例，女23例，年齡37～89歲，平均（61.25±3.74）歲。高分化鱗癌23例，中分化鱗癌42例，低分化鱗癌3例。對(duì)68例患者進(jìn)行跟蹤隨訪，明確患者術(shù)后生存時(shí)間；隨訪間隔時(shí)間為第1年每3個(gè)月1次，第2年每6個(gè)月1次，以后每年1次，直至患者死亡，隨訪時(shí)間截止到2013年9月，中位隨訪時(shí)間為58（36～72）個(gè)月。該研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得所有患者知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診食管鱗癌；經(jīng)臨床評(píng)價(jià)可手術(shù)切除的腫瘤；患者能夠耐受腹部胸部外科手術(shù)或其他治療；既往無(wú)消化系統(tǒng)及其他癌癥病史；在手術(shù)前未進(jìn)行化療或放療等相關(guān)治療；臨床病理資料完整；簽署知情同意書(shū)者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診食管腺癌；未行手術(shù)根治術(shù)者；有腫瘤家族史者；術(shù)前接受過(guò)化療或放療等相關(guān)治療；臨床病理資料有缺失者；未簽署知情同意書(shū)者。

1.2 方法

1.2.1 一般資料 根據(jù)美國(guó)聯(lián)合委員會(huì)癌癥-國(guó)際抗癌聯(lián)盟（AJCC-UICC）分期手冊(cè)TNM分期系統(tǒng)的臨床病理分期進(jìn)行評(píng)價(jià)，臨床病理特點(diǎn)包括患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、TNM分期、腫瘤分化程度等（表1）。

1.2.2 定量蛋白組學(xué) 血清標(biāo)本取材后快速冷凍于液氮中并保存于-80℃冰箱中，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后需先將血清樣本解凍，然后每組選取合適樣品進(jìn)行等體積合并成3組樣本池后，去除血清中的高豐度蛋白質(zhì)，待低豐度蛋白質(zhì)組分濃縮后離心取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量；取約20 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行電泳，使用考馬斯亮藍(lán)染色后評(píng)估原血清和低豐度蛋白樣品；再取約150 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行酶解和肽段定量，然后按照iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit（AB SCIEX）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行8標(biāo)同iTRAQ標(biāo)記肽段，每組標(biāo)記2次進(jìn)行技術(shù)重復(fù)；混合標(biāo)記后的所有肽段，MALDITOF/TOF MS進(jìn)行分析得到多肽片段的定量信息，進(jìn)行SCX預(yù)分級(jí)和質(zhì)譜鑒定分析。

表1 不同生存期食管癌患者的臨床病理資料

1.2.3 Western blot檢測(cè) 取解凍后的血清標(biāo)本約5 μL，加 15 μL去離子水和 5 μL Loading buffer配成25 μL樣本混合液，-20℃冰箱過(guò)夜；使用12%分離膠及4%濃縮膠進(jìn)行制膠，緩慢加入樣本混合液后進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)跑出即可終止，然后轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜后使用封閉液進(jìn)行封閉過(guò)夜，再使用二抗進(jìn)行孵育；然后使用顯影液進(jìn)行顯影、曝光；使用Image J軟件對(duì)所得蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行光密度分析，以ApoD與β-actin光密度的比值來(lái)表示該蛋白在食管癌不同生存期患者血清中的相對(duì)表達(dá)含量。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 將石蠟包埋的組織樣本切成5 μm厚的切片，于64℃烤箱中烘烤1 h，晾至室溫。按SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒（SA2002-兔IgG）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以DAB顯色，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。采用Leica Application Suite圖像采集系統(tǒng)采集圖片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析圖像，以積分光密度（IOD）為指標(biāo)對(duì)各組陽(yáng)性染色做定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

蛋白組學(xué)質(zhì)譜分析使用軟件Mascot 2.2和Proteome Discoverer1.3（thermo）進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析，使用Proteome Discoverer 1.3軟件對(duì)肽段報(bào)告離子峰強(qiáng)度值進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)評(píng)估，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 iTRAQ聯(lián)合MALDI-TOF/TOF MS的結(jié)果

質(zhì)譜分析結(jié)果經(jīng)Mascot 2.2軟件查庫(kù)，對(duì)有明確定量信息的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析顯示：本實(shí)驗(yàn)中共556種蛋白有詳細(xì)的定量信息，其中表達(dá)具有顯著差異性的蛋白有253種，有52種蛋白的表達(dá)隨生存期延長(zhǎng)而上調(diào)，48種蛋白的表達(dá)隨生存期延長(zhǎng)而下調(diào)。本研究進(jìn)一步對(duì)生存期≤3年、≥5年的兩個(gè)極端生存期之間表達(dá)蛋白進(jìn)行比較，經(jīng)篩選并鑒定出與食管癌生存期相關(guān)的五個(gè)關(guān)鍵差異蛋白，依次分別為：碳酸酐酶Ⅰ、碳酸酐酶Ⅱ、血管緊張素、ɑ-2巨球蛋白以及載脂蛋白D（表2）。

由表2可以篩選出ApoD五個(gè)關(guān)鍵差異蛋白，且其表達(dá)情況表明該蛋白與食管癌長(zhǎng)生存期呈明顯正相關(guān)關(guān)系，對(duì)該蛋白進(jìn)一步進(jìn)行heatmap層次聚類分析，發(fā)現(xiàn)各組之間存在明顯的差異（圖1）。

表2 iTRAQ結(jié)合2-D MALDI-TOF/TOF MS技術(shù)篩選出與食管癌生存期相關(guān)的差異蛋白

圖1 ApoD在食管癌及正常人血清中的層次聚類分析

2.2 Western blot結(jié)果

研究結(jié)果顯示ApoD在生存期≥5年組血清中表達(dá)最高，正常人血清中表達(dá)其次，而在生存期≤3年組中表達(dá)最低。生存期≥5年組與正常人組的光密度值相比以及生存期≤3年組與生存期≥5年組的光密度值相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果

ApoD蛋白陽(yáng)性染色細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色或者褐色顆粒，平均積分光密度（IOD/面積）表示免疫反應(yīng)物的表達(dá)強(qiáng)度。研究結(jié)果顯示：ApoD在正常食管鱗狀上皮中高表達(dá)，而在癌組織中低表達(dá)，其中生存期≥5年組表達(dá)情況高于生存期≤3年組；生存期≥5年組與食管正常組織的光密度值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖3）；生存期≤3年組與生存期≥5年組的光密度值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖2 Western blot檢測(cè)ApoD在不同組血清中的表達(dá)。n=10，*P＜0.05

圖3 ApoD在食管癌正常組織及癌組織中的表達(dá)（Masson染色×200）

3 討論

食管癌是世界上最常見(jiàn)的六大惡性腫瘤之一［1］，該病發(fā)病率高，預(yù)后差，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移［4］。河南林州地區(qū)是中國(guó)也是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一，病理分型以鱗癌為主［5］。目前，臨床上多采用TNM分期等方法來(lái)預(yù)測(cè)該病的預(yù)后情況，卻也存在部分TNM分期晚的患者有較長(zhǎng)生存期，所以這類方法并不能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)食管癌的預(yù)后［6］。隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟和多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，關(guān)鍵基因在這一過(guò)程中的表達(dá)改變可能對(duì)食管癌的預(yù)防、診斷和治療都有非常重要的意義［7］。因此，本研究擬從分子生物學(xué)方面尋找到某些生物標(biāo)志物，以期可以快捷準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)食管癌的發(fā)病情況及患者的預(yù)后，從而采取積極的干預(yù)措施。

本研究采用iTRAQ試劑標(biāo)記的熒光膠內(nèi)差異雙向電泳（2-D DIGE）聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸離子化串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF MS）蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，對(duì)生存期≤3年、≥5年的兩個(gè)極端生存期食管癌患者血清蛋白進(jìn)行g(shù)ene ontology分析，獲得與食管癌生存期相關(guān)的血清關(guān)鍵候選蛋白。并結(jié)合heatmap層次聚類分析結(jié)果，得到52種蛋白與食管癌生存期呈正相關(guān)，如載脂蛋白D、ɑ-2巨球蛋白等；有50種蛋白與食管癌生存期呈明顯負(fù)相關(guān)。這與Pawar等［8］的研究基本一致；本研究對(duì)差異蛋白逐個(gè)分析比較，最終鎖定針對(duì)食管癌患者生存期呈正相關(guān)的蛋白ApoD進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

ApoD是與食管癌生存期正相關(guān)的52種蛋白之一，同時(shí)也是一種存在多個(gè)配基的多功能蛋白［9］。既往研究表明，ApoD參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、胚胎的發(fā)育和分化、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生和損傷修復(fù)以及腫瘤發(fā)生等生命活動(dòng)和過(guò)程［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，ApoD在生存期≥5年組血清中表達(dá)最高，正常人血清中表達(dá)其次，而在生存期≤3年組中表達(dá)最低，這也印證了此前一項(xiàng)ApoD與食管癌的相關(guān)研究［11］，表明ApoD是一種強(qiáng)有力的腫瘤生長(zhǎng)活性抑制基因這一發(fā)現(xiàn)。

由于血清中能夠監(jiān)測(cè)到的物質(zhì)多會(huì)受到癌組織的影響，目的蛋白可能在組織中也有類似的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)ApoD在正常食管鱗狀上皮中高表達(dá)，在生存期≥5年組癌組織中表達(dá)次之，在生存期≤3年組癌組織中表達(dá)最低。雖然組織驗(yàn)證的結(jié)果與血清結(jié)果不完全一致，考慮可能是由于ApoD屬于血漿蛋白，在血清中的表達(dá)更為敏感，組織中的表達(dá)趨勢(shì)與之不完全一致也是可能的［12］。本研究中，雖然組織和血清中的ApoD趨勢(shì)不完全一致，但均說(shuō)明該蛋白的高表達(dá)可能預(yù)示著食管癌患者會(huì)有更好的預(yù)后、更長(zhǎng)的生存期限。

同時(shí)，ApoD基因可能具有復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其在腫瘤中的作用及機(jī)制仍存在爭(zhēng)論，如乳腺癌［13］、卵巢癌［14］、前列腺癌［15］、肝癌［16］、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤［17］、大腸癌［18］、食管癌［19］、皮膚惡性黑色素瘤［20］以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤［21］等都能不同程度地檢測(cè)到ApoD。已有數(shù)據(jù)表明，在胃癌等癌癥中，ApoD的高水平和良性預(yù)后有關(guān)，甚至ApoD已經(jīng)作為一種能夠預(yù)測(cè)預(yù)后的生物相關(guān)標(biāo)記被提出來(lái)［22］。本研究結(jié)果顯示ApoD在正常人群血清和食管組織中高表達(dá)，在食管癌患者術(shù)前血清和癌組織低表達(dá)，且生存期≤3年組的表達(dá)情況明顯低于生存期≥5年組。綜上所述，推測(cè)該蛋白高表達(dá)可能在某種程度上抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲，提示患者擁有更長(zhǎng)的生存期，說(shuō)明該蛋白確實(shí)有可能成為預(yù)測(cè)食管癌患者預(yù)后的參考指標(biāo)之一。