HPLC測定天麻配方顆粒中天麻素和對羥基苯甲醇的含量

相繼芬，鄧辰辰，劉圓，韓蕾，徐桂紅，蕭偉*

(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；2.中藥提取精制新技術(shù)重點(diǎn)研究室，江蘇 連云港 222001)

天麻具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽等功能，用于小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐等[1]，是中國的傳統(tǒng)中藥，名貴藥材[2]。中藥配方顆粒為單味中藥經(jīng)現(xiàn)代化提取等過程制成的新型顆粒劑[3]，是中藥飲片的補(bǔ)充形式，既滿足了中醫(yī)臨床辨證論治、隨證加減的臨床用藥特點(diǎn)[4-5]，又有利于現(xiàn)代智能化藥房的標(biāo)準(zhǔn)化。天麻配方顆粒是天麻飲片經(jīng)水提取、濃縮、干燥、制粒等工序制成的單方顆粒劑。天麻素和天麻苷元即對羥基苯甲醇為天麻中主要的藥用活性成分[6]，天麻素具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、安眠等作用[7]，對羥基苯甲醇與天麻素一樣具有鎮(zhèn)痛效果[8]。本文采用高效液相色譜法對天麻配方顆粒中天麻素和對羥基苯甲醇的含量進(jìn)行研究，為制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；Millipore超純水純化系統(tǒng)(美國密理博公司)；KQ-250DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BP211D型電子分析天平(德國Sartorius)；ME104E電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥

天麻配方顆粒(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號：CP161101)；天麻素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110807-201608，純度97.6%)；對羥基苯甲醇(中國食品藥品檢定研究院，批號：111970-201507，純度98.5%)；乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate LP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸(4∶96)；柱溫：30 ℃；檢測波長：220 nm；流速：0.8 mL·min-1。

2.2 對照品溶液的制備

取天麻素對照品、對羥基苯甲醇對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1 mL含天麻素230 μg、對羥基苯甲醇50 μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取天麻配方顆粒適量，研細(xì)，稱取0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取乙腈-水(4∶96)50 mL加入，稱定重量，超聲提取30 min，放冷至室溫，再稱定重量，用乙腈-水(4∶96)補(bǔ)足減失的重量，取續(xù)濾液，即得。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 陰性驗(yàn)證

陰性溶液的制備：天麻配方顆粒在制劑過程中加入一定量的輔料糊精，為考察輔料是否有干擾，按處方比例稱取適量輔料制成陰性樣品，并按2.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，分別精密吸取對照品溶液、陰性供試品溶液、供試品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，見圖1。

注：A.對照品；B.陰性供試品；C.供試品；1.天麻素；2.對羥基苯甲醇。圖1 對照品、陰性供試品、供試品HPLC對比圖譜

結(jié)果表明，陰性供試品溶液對天麻素和對羥基苯甲醇測定無干擾。

3.2 線性關(guān)系考察

3.2.1 天麻素 精密稱取天麻素對照品適量，制得一定濃度的對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.986 2 mg·mL-1)。分別取對照品溶液0.5、1、2、3、5、10 mL分置于6個(gè)容量瓶中，加乙腈-水(4∶96)定容至10 mL，即得質(zhì)量溶度為49.31、98.62、197.24、295.86、493.1、986.2 μg·mL-1的溶液，分別進(jìn)樣5 μL，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，天麻素峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，天麻素在49.31～986.2 μg·mL-1呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程：Y=205.39X-0.072 5，r=0.999 6。

3.2.2 對羥基苯甲醇 精密稱取對羥基苯甲醇對照品適量，制得一定濃度的對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.758 9 mg·mL-1)。分別取對照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、1.5、2.0 mL分置于6個(gè)容量瓶中，加乙腈-水(4∶96)定容至10 mL，即得質(zhì)量溶度分別為7.589、30.356、60.712、91.068、113.835、151.78 μg·mL-1的溶液，分別進(jìn)樣5 μL，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，對羥基苯甲醇峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，對羥基苯甲醇在7.589～151.78 μg·mL-1呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程：Y=390.42X-0.263 2，r=0.999 6。

3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取天麻素和對羥基苯甲醇混合對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其峰面積，天麻素RSD為0.02%，對羥基苯甲醇RSD為0.08%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積。天麻素RSD為0.27%，對羥基苯甲醇RSD為0.38%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批天麻配方顆粒樣品(批號：CP161101)，按制備供試品溶液方法制備，平行制備6份，測定其天麻素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為22.506、22.534、22.500、22.500、22.498、22.531 mg·g-1，6個(gè)測定結(jié)果的RSD為0.07%，對羥基苯甲醇含量結(jié)果分別為2.655、2.655、2.674、2.651、2.651、2.650 mg·g-1，計(jì)算6個(gè)測定結(jié)果的RSD為0.34%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法[9]，取已知含量的樣品(批號：CP161101，天麻素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.51 mg·g-1，對羥基苯甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.65 mg·g-1)約0.25 g，精密稱定，平行稱取6份，置錐形瓶中，各組分別精密加入天麻素對照品溶液(每1 mL含天麻素10.841 mg)0.5 mL；對羥基苯甲醇對照品溶液(每1 mL含對羥基苯甲醇1.584 mg)0.5 mL，精密加入乙腈-水(4∶96)50 mL，超聲提取30 min，放冷，稱定重量，用乙腈-水(4∶96)補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取5 μL，注入液相色譜儀，測定，分別計(jì)算天麻素和對羥基苯甲醇回收率，結(jié)果見表1，結(jié)果表明該方法回收率良好。

表1 天麻素和對羥基苯甲醇加樣回收率(n=6)

3.7 樣品含量測定

取天麻配方顆粒適量，各3份，按照2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測定天麻素和對羥基苯甲醇峰面積，計(jì)算其含量，結(jié)果見表2。

表2 天麻配方顆粒含量測定結(jié)果(n=3)

4 討論

4.1 檢測波長的選擇

實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測器對天麻素和對羥基苯甲醇對照品混合溶液進(jìn)行全波長掃描，并對檢測波長進(jìn)行了選擇。實(shí)驗(yàn)表明，天麻素在220.77 nm處吸收峰響應(yīng)值較高，對羥基苯甲醇在223.40 nm處吸收峰響應(yīng)值較高，其他色譜峰均不干擾測定，并通過參考文獻(xiàn)[10]及《中華人民共和國藥典》2015年版，最終確定220 nm作為天麻素和對羥基苯甲醇共同檢測波長。

4.2 流動相條件的確定

實(shí)驗(yàn)分別采用不同條件(甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液)為流動相進(jìn)行研究考察，結(jié)果表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液為系統(tǒng)條件下天麻素和對羥基苯甲醇均能達(dá)到基線分離，對稱性良好，故最終確定乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相。

4.3 提取條件的確定

考察不同提取溶劑[50%甲醇、50%乙醇、乙腈-水(4∶96)]、不同的提取方法(回流、超聲)和不同提取時(shí)間(15、30、45 min)等因素對提取結(jié)果的影響。最終確定提取方案：以乙腈-水(4∶96)為提取溶劑，超聲提取30 min。

4.4 色譜條件耐用性考察

本文通過對不同品牌高效液相色譜儀、不同品牌色譜柱、不同流速、不同柱溫進(jìn)行考察，結(jié)果表明本文采用的色譜條件耐用性良好。