多指標(biāo)綜合評(píng)分法結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選心痛寧膠囊醇提工藝△

劉怡，如扎·哈布都拉，李露，王萍，2，孟瑤，李玉婷，依孜提·帕力哈提，張麗娟，聶繼紅，2*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000)

心痛寧膠囊是國(guó)醫(yī)大師新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院沈?qū)毞淌谌嗄陙?lái)治療心血管疾病的臨床經(jīng)驗(yàn)方，處方由川芎、當(dāng)歸、厚樸等多味藥材組成，對(duì)治療痰瘀互結(jié)型冠心病療效顯著。方中含有川芎、當(dāng)歸、厚樸等多味藥材，具有擴(kuò)張血管，抗血小板聚集等多重藥理作用[1-5]。原方以傳統(tǒng)湯劑方式服用，將其開發(fā)成膠囊劑則可以克服湯劑服用劑量大、口感差、儲(chǔ)存攜帶不便等不足，最大程度地方便患者。

Box-Behnken響應(yīng)面法是采用多元二次方程來(lái)擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最佳工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法[6]。本課題通過(guò)多指標(biāo)綜合評(píng)分，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選心痛寧膠囊醇提工藝，為該課題的后續(xù)研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Waters-2695)；紫外可見分光光度計(jì)(Cintra 20)；SI-234電子天平[丹佛儀器(北京)有限公司]；AGL-135電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海有限公司)]；SK250LHC超聲清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)：110773-201012)、厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)：110729-200310)和厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)：0730-200206)、蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080-200707)(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；冰醋酸為分析純；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水。

川芎、當(dāng)歸、厚樸等藥材飲片均購(gòu)自于亳州市中正藥材飲片有限公司，由新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部提供，經(jīng)李永和主任中藥師鑒定，結(jié)果均符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部各項(xiàng)有關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 阿魏酸、厚樸酚以及和厚樸酚的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱Symmetry C18(150 mm4.6 mm，5m)；十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動(dòng)相A和B分別為乙腈和1%冰醋酸溶液，按表1所示進(jìn)行梯度洗脫。阿魏酸及厚樸酚類檢測(cè)波長(zhǎng)分別為318、298 nm，體積流量為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10L，柱溫為30 ℃[7-10]。

表1 梯度洗脫

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取適量阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品，加色譜甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.26、0.38 mg·mL-1的混合儲(chǔ)備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取處方中擬采用醇提的藥材，加60%乙醇10倍量，加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液，經(jīng)紗布濾過(guò)，濾液離心60 min后取上清液10 mL，蒸干，干膏加適量色譜甲醇溶解，定容到5 mL容量瓶刻度，經(jīng)0.45m的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 稱取處方中除當(dāng)歸、川芎、厚樸以外的中藥材，按2.1.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.1.5 線性范圍考察 精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合儲(chǔ)備液1、2、3、4 mL用色譜甲醇定容于5 mL量瓶中，得到不同濃度的溶液，同時(shí)取混合儲(chǔ)備液，在2.1.1項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程，結(jié)果見下表2。

表2 回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定得阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為1.70%、0.77%、0.23%，表明儀器的精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按處方比例，稱取6份同一批醇提藥材，按2.1.3項(xiàng)下制備供試品溶液，在2.1.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL，測(cè)定得阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為0.63%、1.06%、1.09%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，在2.1.1項(xiàng)色譜條件下分別于制備后的第0、6、8、12、24、48 h進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣10 μL后得到阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為0.70%、1.13%、1.58%，結(jié)果表明，供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的待測(cè)溶液6份，分別加入阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品0.20、1.34、1.27 mg，按2.1.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣10 μL測(cè)定，結(jié)果平均加樣回收收率分別為95.46%、103.92%、103.13%，RSD分別為2.24%、2.82%、0.57%，結(jié)果表明本品的加樣回收率良好。

注：A.混合對(duì)照品溶液(318 nm)；B.混合對(duì)照品溶液(298 nm)；C.供試品溶液(318 nm)；D.供試品溶液(298 nm)；E.缺阿魏酸陰性樣品(318 nm)；F.缺厚樸酚及和厚樸酚陰性樣品(298 nm)；1.阿魏酸；2.和厚樸酚；3.厚樸酚。圖1 心痛寧膠囊中阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚的HPLC圖

2.2 總黃酮的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，加無(wú)水乙醇充分溶解，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為2.001 mg·mL-1)。

2.2.2 供試品溶液的制備 按擬定的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行提取，備用。

2.2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定 精密移取適量2.2.1項(xiàng)蘆丁對(duì)照品，加入60%乙醇溶液6 mL，5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻靜置6 min后再加10%硝酸溶液1 mL，混勻靜置6 min，最后加入4.3%氫氧化鈉溶液10 mL，混勻靜置15 min后測(cè)定，以相同的方法制備空白液，在400～700 nm[11-13]范圍內(nèi)掃描。結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液在500.8 nm處均有最大吸收，見圖2。

圖2 蘆丁對(duì)照品和樣品的紫外-可見光譜

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 mL，在500.8 nm處測(cè)定上述方法顯色后的不同濃度儲(chǔ)備液的吸光度(A)值。以吸光度為縱坐標(biāo)，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)得到回歸方程：Y=1.418X-0.009 7(r=0.999 4)。表明蘆丁在0.3～1.1 mg范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.5 mL蘆丁對(duì)照品溶液，在500.8 nm處連續(xù)測(cè)定6次上述方法顯色后吸光度，得到RSD值為0.50，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按擬定的實(shí)驗(yàn)方案平行制備6份供試品溶液，在500.8 nm處測(cè)定按2.2.1項(xiàng)顯色后的吸光度，得到RSD值為0.75%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取0.5 mL按上述方法制備的供試品溶液，分別于制備后的第0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定按2.2.1項(xiàng)顯色后的吸光度，得到RSD值為1.97%，結(jié)果表明供試品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下已知濃度的供試品溶液，取樣品與對(duì)照品含量為1∶1平行制備待測(cè)溶液6份，在2.2.1項(xiàng)下測(cè)定其吸光度，結(jié)果得到平均加樣回收率為97.76%，RSD=0.37%，結(jié)果表明本品的加樣回收率良好。

2.3 浸膏得率的測(cè)定

將50 mL供試液精密吸取于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干后放入105 ℃烘箱內(nèi)干燥3 h，在干燥器中冷卻后迅速精密稱定重量，計(jì)算其浸膏得率[14]。

(1)

2.4 單因素試驗(yàn)

分別對(duì)提取次數(shù)、提取時(shí)間、加醇濃度、加醇倍量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)確定Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平范圍[15-17]。

2.4.1 提取時(shí)間初步考察 按擬定處方量稱取藥材，將加醇倍量固定為10倍，加醇濃度固定為60%，提取次數(shù)固定為1次，考察提取時(shí)間分別為30、60、90、120 min時(shí)的綜合評(píng)分，結(jié)果綜合評(píng)分在30～60 min時(shí)呈遞增趨勢(shì)，60～90 min時(shí)呈遞減趨勢(shì)，故最佳提取時(shí)間確定60 min。

2.4.2 加醇濃度初步考察 按擬定處方量稱取藥材，將加醇倍量固定為10倍，提取時(shí)間固定為1 h，提取次數(shù)固定為1次，考察加醇濃度分別為50%、60%、70%、80%時(shí)的綜合評(píng)分，結(jié)果綜合評(píng)分在50%～60%呈遞增趨勢(shì)，60%～70%呈降低趨勢(shì)，故最佳加醇濃度定為60%。

2.4.3 加醇倍量初步考察 按擬定處方量稱取藥材，將加醇濃度固定為60%，提取時(shí)間固定為1 h，提取次數(shù)固定為1次，考察加醇倍量分別為6倍、8倍、10倍、12倍時(shí)的綜合評(píng)分，結(jié)果綜合評(píng)分在8倍～10倍呈遞增趨勢(shì)，10倍～12倍呈下降趨勢(shì)，故最佳加醇倍量定為10倍。

2.4.4 提取次數(shù)的初步考察 按擬定處方量稱取藥材，將加醇倍量固定為10倍，加醇濃度固定為60%，提取時(shí)間固定為1 h，分別考察提取1、2、3次的綜合評(píng)分，最終綜合評(píng)分分別為59.16%、94.10%、96.45%，由于提取2次和提取3次的綜合評(píng)分結(jié)果差別不大，從工業(yè)化大生產(chǎn)節(jié)約成本的角度考慮，提取次數(shù)確定為2次。

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按擬定處方量稱取醇提藥材，根據(jù)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)醇提工藝的影響，確定綜合評(píng)分=阿魏酸×0.4+總厚樸酚×0.2+總黃酮×0.2+浸膏得率×0.2(總厚樸酚=厚樸酚×0.5+和厚樸酚×0.5)，提取次數(shù)固定為1次，以提取時(shí)間(X1)、加醇濃度(X2)、加醇倍量(X3)作為考察指標(biāo)進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)[18-19]，因素及水平見表3。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平

采用Design-Expert 軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，對(duì)加醇倍量、加醇濃度、提取時(shí)間進(jìn)行研究[20-21]，結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5.2 模型擬合 利用方差分析對(duì)各因素進(jìn)行多元二次回歸，得到的回歸方程Y=90.46+11.92X1+2.81X2+3.77X3-3.55X1X2-2.99X2X3-1.71X1X3-13.41X12-7.29X22-8.04X32，由表5可知，X1、X2、X12、X22、X32具有顯著影響，其影響程度為X2>X1>X3；失逆項(xiàng)P>0.05，說(shuō)明失擬不顯著，因此本回歸方程能較好地分析與預(yù)測(cè)本研究的醇提工藝。根據(jù)回歸分析結(jié)果繪制三維響應(yīng)面圖，見圖3～4。

表5 回歸模型的方差分析

圖3 各因素對(duì)綜合評(píng)分的三維響應(yīng)面圖

圖4 提取工藝對(duì)各因素之間的等高線圖

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析，最佳醇提工藝：加入60.53%的乙醇10.36倍，提取72 min。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)所需，將最佳醇提工藝確定為60%的乙醇10倍量，提取60 min。按照最佳醇提工藝，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，其綜合評(píng)分分別為96.36、98.04、95.80，平均綜合評(píng)分為96.73(RSD為1.21%)，與預(yù)測(cè)值(93.41)相似，說(shuō)明次二項(xiàng)式方程的適用性良好。優(yōu)選的提取工藝合理，可行。

3 討論

參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》及文獻(xiàn)方法測(cè)定阿魏酸及總厚樸酚含量時(shí)，考察了乙腈、甲醇、冰醋酸、磷酸等多種流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)乙腈-冰醋酸體系對(duì)于阿魏酸及總厚樸酚體系峰型較好，保留時(shí)間適宜?？疾毂姿釙r(shí)發(fā)現(xiàn)，1%冰醋酸使各色譜峰的分離度及峰型效果最好，為最優(yōu)濃度，調(diào)整乙腈-1%冰醋酸溶液不同配比，最后選擇流動(dòng)相(0～17 min，12%乙腈；17～18 min，12%～54%乙腈；18～35 min，54%乙腈)。

采用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮時(shí)，在1 h內(nèi)顯色結(jié)果穩(wěn)定，超過(guò)1 h，供試品溶液則出現(xiàn)絡(luò)合物沉淀，所以應(yīng)在1 h內(nèi)完成顯色測(cè)定。

在研究初始階段，首先采用文獻(xiàn)研究法查閱相關(guān)文獻(xiàn)，最終確定了處方中各味藥材有效成分的理化性質(zhì)及藥理作用，確定其中部分藥材使用醇提工藝，故采用多指標(biāo)綜合評(píng)分結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法，以阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚、總黃酮的含量及浸膏得率作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)研究獲取了更加優(yōu)化的心痛寧膠囊醇提工藝。此結(jié)果為工業(yè)化大生產(chǎn)奠定了研究基礎(chǔ)，為以后的科研創(chuàng)新提供了思路。