提取-共沸精餾耦合技術(shù)與水蒸氣蒸餾法提取中藥揮發(fā)油比較研究△

李佳佳，鄭鵬，頓佳穎，郭秋紅，李春花*

(1.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200；2.河北中醫(yī)學(xué)院科技處，河北 石家莊 050200)

充血性心力衰竭(簡稱CHF)，是指心血管疾病發(fā)展到一定的嚴(yán)重程度，心臟失代償?shù)囊环N臨床綜合征。祖國醫(yī)學(xué)在治療CHF方面積累了豐富的經(jīng)驗，目前的研究一致認(rèn)為心力衰竭屬于本虛標(biāo)實之證。葶藶生脈組方是全國名老中醫(yī)邢月朋根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)出的治療氣虛血瘀、陽虛水停型充血性心力衰竭的經(jīng)驗方，方中的桂枝、白術(shù)屬辛溫解表藥，而揮發(fā)油是解表藥“辛”味的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1]，現(xiàn)代藥理證實桂枝中桂皮油有利尿、強心、改善心肌缺血和供氧等作用，白術(shù)揮發(fā)油具有健脾運脾作用[2-8]。

目前中藥制劑生產(chǎn)中，揮發(fā)油提取多采用水蒸氣蒸餾法[9]，該工藝用于提取水溶性較強的揮發(fā)油時提取效率較低，而提取-共沸精餾耦合技術(shù)對這類中藥揮發(fā)油的提取有顯著優(yōu)勢?？紤]白術(shù)、桂枝混合揮發(fā)油有一定的親水性，故本文采用提取-共沸精餾耦合技術(shù)(WER)與水蒸氣蒸餾法(SD)提取白術(shù)、桂枝揮發(fā)油，通過正交試驗考察浸泡時間、提取時間及加水倍量對揮發(fā)油得率的影響，優(yōu)化其工藝條件，并對兩種工藝所提取的揮發(fā)油進(jìn)行HPLC、GC分析，篩選出揮發(fā)油的最佳提取方法及工藝，最大限度保留揮發(fā)性成分。

1 儀器與材料

1.1 儀器

安捷倫7890B GC B.02.03.2(安捷倫科技公司)，配備有SPH-300氫氣發(fā)生器(北京中惠普分析技術(shù)研究所)，SPB-3全自動空氣源(北京中惠普分析技術(shù)研究所)；Waters e2695高效液相色譜儀(Waterse 2695 Separations Module，2489 UV/Vis Detector)；分析天平(上海精科儀器廠，TG328B)；LQ-A10002電子天平(上海樂祺精密電子廠)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，桂枝為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝，購自安國藥材市場，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院侯芳潔老師鑒定符合《中華人民共和國藥典》2015版一部相關(guān)項下規(guī)定；無水硫酸鈉(分析純，深圳市中發(fā)源生物科技有限公司)；無水乙醇(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；桂皮醛(批號：H02M6Q1，上海源葉生物科技有限公司)；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ(批號：ZM0311BC13，上海源葉生物科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 WER與SD提取白術(shù)、桂枝揮發(fā)油

分別稱取桂枝、白術(shù)(最粗粉)，放入兩個圓底燒瓶中并加入規(guī)定的加水量，浸泡一定時間，然后分別連接提取-共沸精餾耦合裝置和揮發(fā)油測定器，加熱回流提取至規(guī)定時間。

2.2 提取條件的優(yōu)化

兩種工藝正交試驗設(shè)計與結(jié)果：選用浸泡時間、提取時間、加水倍量三個因素，采用正交表L9(34)安排試驗，優(yōu)化WER與SD的工藝條件，因素水平見表1，正交試驗設(shè)計及極差分析結(jié)果見表2，表3。

表1 揮發(fā)油提取工藝因素水平表

表2 揮發(fā)油提取正交試驗結(jié)果表

表3 方差分析表

注：F0.01(1，2)=99，F(xiàn)0.05(1，2)=19。

由表2中R值可知，三個因素對兩種工藝的影響結(jié)果均為A>B>C，表3中P值分析可知，浸泡時間與提取時間對提取工藝均有顯著影響，其中WER工藝下，浸泡時間具有極顯著性差異，WER工藝下最佳水平組合為A3B3C2，即浸泡3 h、提取6 h、加水量10倍，SD工藝下最佳水平組合為A3B3C1，即浸泡3 h、提取6 h、加水量8倍。

2.3 WER與SD提取下?lián)]發(fā)油得率的配對T檢驗分析

由表2可知，WER的揮發(fā)油得率均高于SD的揮發(fā)油得率，因此分別對兩種提取工藝下白術(shù)、桂枝揮發(fā)油得率進(jìn)行配對T檢驗，考察兩種工藝下?lián)]發(fā)油得率是否存在顯著性差異，結(jié)果見表4。

表4 WER與SD提取下的揮發(fā)油得率的T檢驗結(jié)果

表4中，第一項為WER與SD的揮發(fā)油得率差值的均值，第二項為WER與SD的揮發(fā)油得率差值的標(biāo)準(zhǔn)方差，第三項為第一項的標(biāo)準(zhǔn)誤差估計值。由于WER與SD的揮發(fā)油得率的P<0.01，故WER與SD工藝下白術(shù)、桂枝揮發(fā)油得率具有顯著性差異，說明WER工藝能顯著提高白術(shù)、桂枝混合揮發(fā)油得率。

2.4 驗證試驗

采用上述確定的最佳工藝條件，WER為浸泡3 h、提取6 h、加水量10倍，SD為浸泡3 h、提取6 h、加水量8倍。分別采用WER與SD提取3 批白術(shù)、桂枝混合揮發(fā)油，驗證試驗所得揮發(fā)油得率均高于正交試驗中揮發(fā)油得率，說明本次正交試驗所篩選的工藝是合理、可行的，并且WER比SD工藝下?lián)]發(fā)油得率更高，確定采用WER提取白術(shù)、桂枝混合揮發(fā)油。具體數(shù)據(jù)見表5。

表5 兩種工藝在最佳提取條件下的驗證試驗結(jié)果

2.5 WER和SD兩種工藝提取白術(shù)、桂枝混合揮發(fā)油色譜比較

采用上述確定的最佳工藝條件，WER：浸泡3 h、提取6 h、加水量10倍，SD：浸泡3 h、提取6 h、加水量8倍，對提取得到的混合揮發(fā)油并進(jìn)行GC、HPLC比較研究。GC色譜條件：安捷倫Hp-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫(90～180 ℃)，初始溫度90 ℃，保持2 min；以3 ℃·min-1的速率升至140 ℃，保持6 min；再以7 ℃·min-1的速率升溫至180 ℃，保持5 min。HPLC色譜條件：色譜柱為YMC J’sphere ODS-H80 C18(250 mm×4.6 mm，4 μm)；流動相為乙腈(A)-水(B)(60∶40)，流速 1.0 mL·min-1，柱溫 30 ℃，檢測波長 220 nm。

經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)WER所提揮發(fā)油，桂皮醛與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的成分含量明顯提高，桂皮醛的含量由SD下的0.096 7 mg提升到WER下的0.286 6 mg，提高了2.96倍，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的含量由SD下的11.259 8 mg提升到WER下的22.082 3 mg，提高了1.97倍，但組分成分之間并未發(fā)生較大變化，說明WER能提高揮發(fā)油中有效成分含量。見圖3。

注：A.提取-共沸精餾工藝所提揮發(fā)油；B.水蒸氣蒸餾工藝所提揮發(fā)油。圖3 提取-共沸精餾工藝與水蒸氣蒸餾工藝比較

3 討論

目前多采用水蒸氣蒸餾法(SD)提取揮發(fā)油，現(xiàn)有報道也有采用超臨界萃取法(SFE)對揮發(fā)油進(jìn)行提取[10-15]，但是采用SD技術(shù)提取像白術(shù)、桂枝這類含量低、水溶性較強的揮發(fā)油時易發(fā)生乳化反應(yīng)，降低揮發(fā)油得率，而SFE技術(shù)雖能提高揮發(fā)油得率，但得到的揮發(fā)性成分會產(chǎn)生較大變化，不能保證揮發(fā)油的藥效與安全性，提取-共沸精餾耦合技術(shù)(WER)能有效提高這類揮發(fā)油的收率和成分含量[16]。本研究采用正交試驗法，優(yōu)選出兩者的最佳提取條件，并通過對最佳提取條件的比較，篩選出其最佳工藝及條件，旨在合理有效提取揮發(fā)油，提高制劑工藝水平。

揮發(fā)油得率是評價提取工藝的一重要指標(biāo)，但所得揮發(fā)油的品質(zhì)是否發(fā)生改變，僅使用肉眼觀察并不確切，故將揮發(fā)油中有效成分的含量作為另一重要指標(biāo)。因此本研究在篩選得到最佳提取工藝后，分別對揮發(fā)油進(jìn)行HPLC、GC分析。現(xiàn)代藥理研究表明，桂皮醛是桂枝揮發(fā)油的主要有效成分，白術(shù)揮發(fā)油的主要成分為蒼術(shù)酮，但其性質(zhì)并不穩(wěn)定，長時間加熱與光照，蒼術(shù)酮發(fā)生氧化分解，轉(zhuǎn)化為白術(shù)內(nèi)酯類有效成分，故本研究選擇桂皮醛與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ為綜合指標(biāo)，進(jìn)行色譜分析。

本實驗的研究結(jié)果說明，WER與SD相比較，WER確實能提高揮發(fā)油得率，并且提升有效成分的含量。兩者所篩選出最佳工藝有所不同，WER下加水量為10倍量的水，SD工藝下加水量為8倍量的水，分析原因，共沸精餾柱長度約80 cm，揮發(fā)油需經(jīng)過一定長度的分離，所以需要更多量的水，并且精餾柱中的填充物使得氣、液兩相逆流多級接觸，易揮發(fā)成分從液相向氣相中轉(zhuǎn)移，而難揮發(fā)組分由氣相向液相中遷移，使得到的揮發(fā)油更為純粹，有效成分含量得到提高，提升傳質(zhì)效率[11]。

致謝：本次研究感謝科研中心張闖老師的幫助。