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    當(dāng)歸補(bǔ)血湯對糖尿病大鼠肝臟、骨骼肌中PKC-ζ表達(dá)的影響*

    2018-11-16 07:51:02張曼玲王秀萍張瑩雯
    天津中醫(yī)藥 2018年11期
    關(guān)鍵詞:列酮吡格骨骼肌

    艾 望,周 珍,張曼玲,王秀萍,張瑩雯

    (武漢大學(xué)中南醫(yī)院中醫(yī)科,武漢 430071)

    2型糖尿?。═2DM)是由胰島素分泌和(或)功能缺陷所導(dǎo)致的以高血糖為特征的代謝性疾病,T2DM患者占中國糖尿病人口的90%以上[1]。胰島素抵抗在T2DM發(fā)病中起重要作用,并貫穿于T2DM全過程。蛋白激酶 C-ζ(PKC-ζ)是蛋白激酶 C(PKC)的一種亞型,屬于多功能絲氨酸和蘇氨酸激酶,其結(jié)構(gòu)和功能與經(jīng)典PKC相比具有明顯的區(qū)別[2]。PKC-ζ屬于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)下游信號分子,參與完成胰島素刺激的脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞攝取葡萄糖的最后生物學(xué)事件[3-5]。

    課題組前期研究表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯對糖尿病大鼠有降低血糖、血脂以及心血管、腎臟、神經(jīng)等多種并發(fā)癥的保護(hù)作用,對核因子-κB(NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子等多個(gè)靶點(diǎn)有抑制作用[6-9]。設(shè)想當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以通過調(diào)控PKC-ζ表達(dá),從而達(dá)到改善胰島素抵抗,調(diào)節(jié)血糖的作用。

    本文旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從補(bǔ)氣生血的古典經(jīng)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯中探討其增加胰島素敏感性,改善糖尿病大鼠胰島素抵抗的科學(xué)內(nèi)涵。

    1 材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級純系正常SD雄性大鼠50只,10周齡,200~220 g,購于武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號:SCXK2008-0004]。

    1.2 實(shí)驗(yàn)藥材 當(dāng)歸補(bǔ)血湯(黃芪∶當(dāng)歸=2∶1)由武漢大學(xué)中南醫(yī)院中藥房提供,黃芪、當(dāng)歸生藥浸水30 min,煎2次,混勻煎煮液,冷卻后放于4℃冰箱備用。吡格列酮片(卡司平)購自武漢大學(xué)中南醫(yī)院西藥房。

    1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 鏈脲佐菌素(STZ),購于美國Sigma公司,溶于1%檸檬酸鈉緩沖液,pH 4.3;大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定試劑盒(貨號E-ELR0023c);PKC-ζ兔抗大鼠一抗購于 Abcam公司(批號ab59364);HRP標(biāo)記山羊抗兔購于ASPEN(批號AS-1107);DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;牛血清白蛋白(BSA)購于Roche公司。

    1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 穩(wěn)豪倍優(yōu)型強(qiáng)生血糖儀及血糖試紙,美國強(qiáng)生公司;倒置熒光顯微鏡IX51,OLYMPUS;普通光學(xué)顯微鏡 CX-21,OLYMPUS;成像系統(tǒng)MicroPublisher,Q-IMAGING;切片機(jī) RM2016,上海徠卡儀器有限公司。

    2 方法

    2.1 飼養(yǎng)條件 所有大鼠均在武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。室溫(22±2)℃、相對濕度(55±5)%、光照周期12~12 h。實(shí)驗(yàn)期間保證所有大鼠飲水、標(biāo)準(zhǔn)飲食充足,定時(shí)更換墊料。

    2.2 模型制備與分組給藥 50只大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)選取20只大鼠分為空白對照組(n=10)和當(dāng)歸補(bǔ)血湯組(n=10),給予普通飼料飼養(yǎng)。余30只給予高脂高糖飼料飼養(yǎng),4周后,禁食12 h,注射小劑量STZ(35 mg/kg),空白對照組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯組給予等量檸檬酸鈉緩沖液,72 h后尾靜脈取血測血糖,大鼠血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功,可納入實(shí)驗(yàn)[10]。測得30只大鼠全部造模成功,隨機(jī)分為T2DM模型組(n=10)、T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組(n=10)、T2DM+吡格列酮組(n=10)。對空白對照組和T2DM模型組給予生理鹽水5 mL/(kg·d)灌胃,當(dāng)歸補(bǔ)血湯組和T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯3.57 g/(kg·d)灌胃,T2DM+吡格列酮組給予吡格列酮10 mg/(kg·d)灌胃。所有大鼠連續(xù)給藥和觀察5周后取材。

    2.3 一般情況 觀察大鼠飲水量、進(jìn)食量、尿量、精神、毛色、反應(yīng)力等并作記錄。

    2.4 體質(zhì)量、血糖、血清胰島素測定 所有組每周末測大鼠體質(zhì)量,采用眼內(nèi)眥靜脈取血測空腹血糖及空腹胰島素含量。血糖儀及配套試紙測定各組大鼠空腹血糖(FPG),ELISA法測大鼠血清空腹胰島素(FINS)。

    2.5 免疫組化檢測 無菌條件下取肝臟和骨骼肌,用4%多聚甲醛固定,將組織石蠟包埋切片。再將切片經(jīng)過脫蠟至水、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗3次、新鮮配置的乙二胺四乙酸(EDTA)修復(fù)液修復(fù)、冷卻、PBS洗3次、3%H2O2溶液避光孵育10 min、5%BSA封閉、加一抗、復(fù)溫、洗去一抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、洗去二抗、DAB顯色、Mayer蘇木素復(fù)染、脫水透明封片。將封固好的切片晾干后,置于倒置顯微鏡用200倍視野選取視野,每個(gè)組織片選取3個(gè)200倍視野來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Image Pro-Plus 6.0軟件分析免疫組化圖片方法:每組內(nèi)每張切片分別隨機(jī)挑選3個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照。讓組織充滿整個(gè)視野再進(jìn)行拍照。對每張照片應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(IOD值)。IOD值越大,表示陽性表達(dá)越強(qiáng)。

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中未出現(xiàn)大鼠死亡情況。造模成功后糖尿病大鼠進(jìn)水量、攝食量、尿量明顯增加,活動(dòng)減少,反應(yīng)遲鈍,皮毛凌亂,色澤暗淡。這些情況在T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組和T2DM+吡格列酮組得到明顯改善。

    3.2 體質(zhì)量變化、FPG和FINS 灌胃后空白對照組與當(dāng)歸補(bǔ)血湯組體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;T2DM模型組、T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、T2DM+吡格列酮組糖尿病大鼠體質(zhì)量低于空白對照組(P<0.05);T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、T2DM+吡格列酮組體質(zhì)量高于T2DM 模型組(P<0.05)。

    灌胃后空白對照組與當(dāng)歸補(bǔ)血湯組FPG、FINS濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;T2DM模型組、T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、T2DM+吡格列酮組大鼠FPG、FINS高于空白對照組(P<0.05);T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、T2DM+吡格列酮組FPG、FINS濃度較T2DM模型組下降(P<0.05),且T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組和T2DM+吡格列酮組組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見表1。

    表1 灌胃后各組大鼠體質(zhì)量變化、FPG和FINS濃度(x±s)Tab.1 Changes of body weight,fasting blood glucoseand fasting insulin concentrations of rats in each group after gavage(x±s)

    3.3 肝臟、骨骼肌組織中PKC-ζ表達(dá) 圖像分析系統(tǒng)檢測肝臟組織和骨骼肌組織中PKC-ζ表達(dá)情況:肝臟和骨骼肌組織各組之間PKC-ζ表達(dá)趨勢相同??瞻讓φ战M與當(dāng)歸補(bǔ)血湯組肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞上PKC-ζ廣泛分布,呈棕黃色,強(qiáng)陽性,且空白對照組與當(dāng)歸補(bǔ)血湯組無明顯區(qū)別;T2DM模型組、T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、T2DM+吡格列酮組表達(dá)量低于空白對照組(P<0.05);T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、T2DM+吡格列酮組較T2DM模型組表達(dá)量升高(P<0.05),且T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組與T2DM+吡格列酮組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見表2、圖1、圖2。

    表2 各組肝臟、骨骼肌IOD值(x±s)Tab.2 IOD value of liver and skeletal muscle in each group(x±s)

    4 討論

    糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇,《外臺秘要》記載:“渴而飲水多,小便數(shù)……甜者,皆是消渴病也?!毕实幕静C(jī)是陰虛燥熱:初期為陰津虧損,漸至陰傷及氣,出現(xiàn)氣陰兩虛,氣虛則運(yùn)血、生血無力,以致血虛燥熱,陰虛為本,燥熱為標(biāo),互為因果,病發(fā)消渴。因此,消渴的治療重在補(bǔ)氣養(yǎng)陰生血。

    當(dāng)歸補(bǔ)血湯作為補(bǔ)氣生血的代表方,始載于李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》,全方由黃芪、當(dāng)歸以5∶1的比例組成,主治“血虛發(fā)熱”證候。在臨床工作中,研究者將當(dāng)歸補(bǔ)血湯應(yīng)用于糖尿病及并發(fā)癥治療近30年,發(fā)現(xiàn)根據(jù)糖尿病所處不同階段,調(diào)整原方中黃芪、當(dāng)歸比例,可取得更好的臨床療效。故本研究加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯是以李東垣所創(chuàng)制的當(dāng)歸補(bǔ)血湯為基方,加大當(dāng)歸的用量,調(diào)整黃芪、當(dāng)歸用量之比為2∶1。黃芪健脾益氣,當(dāng)歸養(yǎng)血活血,則陽生陰長,氣旺血生,虛熱自退。

    PKC-ζ在機(jī)體內(nèi)分布廣泛,具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)控基因表達(dá)、影響免疫功能、參與代謝調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等多種作用。在靜息狀態(tài)下,PKC以無活性的形式存在于細(xì)胞漿中,當(dāng)存在外界刺激時(shí)(如高糖狀態(tài)),受其特異性底物吸引由胞液向胞膜轉(zhuǎn)移,通過多種膜蛋白的磷酸化作用使其構(gòu)象改變,致使PKC信號通路激活,但PKC-ζ轉(zhuǎn)位機(jī)制目前仍未十分明確[11]。近年來,關(guān)于PKC-ζ在糖尿病中的作用研究逐步深入,許多報(bào)道證實(shí)其與胰島素抵抗的形成關(guān)系密切。T2DM的胰島素抵抗屬獲得性胰島素抵抗,主要由胰島素受體后因素導(dǎo)致,包括胰島素受體底物1(IRS-1)磷酸化障礙、PI3K活化障礙、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(GLUT4)合成與轉(zhuǎn)位異常、細(xì)胞內(nèi)葡萄糖磷酸化障礙等[12-13]。PKC-ζ改善胰島素抵抗可能是通過促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵蛋白GLUT-4的表達(dá)及膜轉(zhuǎn)位實(shí)現(xiàn)的:當(dāng)胰島素與受體結(jié)合后,激活I(lǐng)RS-1/2,進(jìn)一步激活經(jīng)典PI3K-PIP3-PDK1 通路,從而激活 PKC-ζ,PKC-ζ通過誘導(dǎo) GLUT4轉(zhuǎn)位,參與胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),介導(dǎo)胰島素將血糖轉(zhuǎn)運(yùn)至肌肉、脂肪組織及肝臟中。有研究發(fā)現(xiàn)活化的PKC-ζ刺激GLUT4轉(zhuǎn)位,而失活的PKC-ζ則部分抑制GLUT4轉(zhuǎn)位,PKC-ζ抑制劑還可阻斷岡田軟海綿酸刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖轉(zhuǎn)位[14]。

    圖1 各組大鼠肝臟中PKC-ζ的表達(dá)Fig.1 Expression of PKC-ζin the liver of rats in each group

    圖2 各組大鼠骨骼肌中PKC-ζ的表達(dá)Fig.2 Expression of PKC-ζin skeletal muscle of ratsin each group

    本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),造模成功后,T2DM大鼠出現(xiàn)多飲多食多尿、體質(zhì)量減輕、血糖升高、胰島素濃度升高等異常,而經(jīng)當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療后的大鼠“三多一少”癥狀明顯好轉(zhuǎn),F(xiàn)PS、FINS濃度顯著降低,且與西藥吡格列酮療效無明顯差異,提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯可改善胰島素抵抗,降低血糖。免疫組化T2DM大鼠肝臟、骨骼肌組織中PKC-ζ的表達(dá)明顯減少,而經(jīng)當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療后,PKC-ζ表達(dá)量增加,提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)節(jié)血糖的作用可能與其促進(jìn)肝臟、骨骼肌組織中PKC-ζ的表達(dá)有關(guān),但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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