明目地黃丸對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠細(xì)胞自噬及Akt—mTOR通路的影響

徐趙釹　章仕淼　劉玲玲

[摘要] 目的 探討明目地黃丸對糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）大鼠視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞自噬及對Akt-mTOR信號通路的影響。 方法 采用高脂高糖飼料飼養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素（40 mg/kg）法制備DR大鼠模型，采用隨機數(shù)字表法分為模型組、羥苯磺酸鈣組（150 mg/kg）和明目地黃丸低（150 mg/kg）、中（300 mg/kg）、高（600 mg/kg）劑量組，每組10只，另設(shè)正常對照組10只，連續(xù)用藥10周，監(jiān)測各組大鼠體重及血糖。給藥10周后，透射電子顯微鏡觀察視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞自噬小體數(shù)量；蛋白印跡法檢測視網(wǎng)膜組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白水平。 結(jié)果 與正常對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織現(xiàn)空泡樣變化、細(xì)胞排列稀疏紊亂等病理變化，自噬小體數(shù)目明顯減少（P < 0.05），Beclin、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P < 0.05），p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P < 0.05）；與模型組比較，明目地黃丸低、中、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化均顯著改善（P < 0.05），自噬小體數(shù)目顯著增多（P < 0.05），Beclin、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P < 0.05），p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P < 0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。 結(jié)論 明目地黃丸能抑制DR大鼠視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞自噬過程，其機制可能通過Akt-mTOR信號通路調(diào)控自噬相關(guān)蛋白表達(dá)而實現(xiàn)。

[關(guān)鍵詞] 明目地黃丸；糖尿病視網(wǎng)膜病變；細(xì)胞自噬；Akt-mTOR信號通路

[中圖分類號] R587.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）07（b）-0016-06

Effects of Mingmu Dihuang Pills on autophagy and Akt-mTOR signaling pathway in retinal tissue of diabetic retinopathy rats

XU Zhaonü ZHANG Shimiao LIU Lingling

Department of Endocrinology， Wenzhou Central Hospital， Zhejiang Province， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of Mingmu Dihuang Pills on autophagy and Akt-mTOR signaling pathway in retinal tissue of diabetic retinopathy （DR） rats. Methods The DR rat model was prepared by high fat and high sugar feed combined with intraperitoneal injection of Streptozotocin （40 mg/kg） method， and they were divided into model group， Calcium Dobesilate group （150 mg/kg）， low （150 mg/kg）， medium （300 mg/kg）， high （600 mg/kg） dose of Mingmu Dihuang Pills groups by random number table method， with 10 rats in each group， and 10 rats were selected as normal control group， all the rats were given the medicine continuously for 10 weeks， the weight and blood sugar of the rats in each group were monitored. After 10 weeks of administration， the number of autophagic corpuscles in the retinal tissue was observed by transmission electron microscope； Western blot was used to detect autophagy related protein Beclin1， microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ （LC3-Ⅱ）， Akt， p-Akt， mTOR and p-mTOR protein in retinal tissue. Results Compared with the normal control group， the retina tissue of rats in the model group showed the changes of vacuoles， the cells arranged sparsely and disorder and so on， the number of autophagic corpuscles decreased significantly （P < 0.05）， the expression of Beclin and LC3-Ⅱ protein was obviously down-regulated （P < 0.05）， the expression of p-Akt and p-mTOR protein was significantly up-regulated （P < 0.05）； compared with the model group， the pathological changes of rats retina tissue in the low， medium and high dose of Mingmu Dihuang Pills groups were significantly improved （P < 0.05）， the number of autophagic corpuscles increased significantly （P < 0.05）， the expression of Beclin and LC3-Ⅱ protein was significantly up-regulated （P < 0.05）， the expression of p-Akt and p-mTOR protein was obviously down-regulated （P < 0.05）， in dose-dependent manners. Conclusion Mingmu Dihuang Pills can inhibit the process of autophagy in retinal tissue of diabetic retinopathy rats， and its mechanism may be achieved by the regulating the expression of autophagy related proteins through the Akt-mTOR signaling pathway.

[Key words] Mingmu Dihuang Pills； Diabetic retinopathy； Autophagy of cells； Akt-mTOR signal pathway

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是由于視網(wǎng)膜長期處于高糖環(huán)境，導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障被破壞，視網(wǎng)膜發(fā)生損傷的一種疾病，是糖尿病常見并發(fā)癥之一[1]。隨著糖尿病患者病程的增加和年齡的增長，DR的發(fā)生率逐漸增加。研究發(fā)現(xiàn)，自噬功能紊亂在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生過程中具有重要作用，高血糖環(huán)境可抑制視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞自噬作用，導(dǎo)致活性氧、晚期糖化終末產(chǎn)物等代謝產(chǎn)物累積，造成視網(wǎng)膜損傷[2]。中醫(yī)認(rèn)為，DR是由血瘀絡(luò)阻、氣陰雙虛引起。明目地黃丸為我國特色中藥制劑，以山茱萸、熟地黃、茯苓、山藥、白芍等多味中藥組成，具有養(yǎng)肝、滋腎、明目等藥理活性[3-4]。臨床應(yīng)用多年，可有效減少糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者出血斑面積及微血管瘤數(shù)，改善患者視力，臨床療效明確[5]，但其作用機制尚不清楚。本研究通過構(gòu)建DR大鼠模型，觀察明目地黃丸對DR模型大鼠視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞自噬，以及對視網(wǎng)膜組織中Akt-mTOR信號通路的影響，試圖揭示明目地黃丸改善DR的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物 明目地黃丸：由山茱萸、熟地黃、茯苓、牡丹皮、山藥、枸杞子、白芍等組成，北京同仁堂有限公司，批號：Z11020166。羥苯磺酸鈣分散片，江蘇萬高藥業(yè)有限公司，批號：H20130288。

1.1.2 動物 雄性健康SPF級SD大鼠，體重（180±10）g，7～8周，上海邦耀生物公司，合格證號：0150523。所有實驗動物均于浙江省溫州市中心醫(yī)院（以下簡稱“我院”）實驗動物中心常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，飲食。所有實驗均經(jīng)我院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。高糖高脂飼料及常規(guī)顆粒飼料，北京博奧派克生物公司。

1.1.3 試劑 鏈脲佐菌素（美國Sigma公司，批號：18883-66-4）；4%多聚甲醛（批號20150215）、戊二醛（批號：20160427）、戊巴比妥鈉（批號：20160108）購自成都科龍化工試劑廠；DAB顯色試劑盒（中杉金橋公司，批號：ZLI-9018）；Anti-Beclin、Anti-LC3-Ⅱ、Anti-p-Akt、Anti-Akt、Anti-p-mTOR、Anti-mTOR、Anti-GAPDH購自美國CST公司。

1.1.4 儀器 EM-1400透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；RM2165石蠟切片機（德國Leica公司）；LGJ100冷凍干燥機（美國松源華興科技發(fā)展有限公司）；BHS-2普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；DYCP-31DN型蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）；1703940型轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 采用高脂高糖飼料飼養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素（40 mg/kg）法制備DR大鼠模型。術(shù)前行常規(guī)血糖檢測，入選大鼠血糖水平均正常。采用高脂高糖飼料飼喂造模大鼠，6周后，禁食12 h，給予大鼠40 mg/kg鏈脲佐菌素（溶于0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液，新鮮配置）腹腔注射；正常對照組大鼠采用常規(guī)飼料飼養(yǎng)，注射等體積0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液。72 h后，檢測各大鼠空腹時血糖水平，以禁食4 h后血糖≥16.67 mmol/L的大鼠為糖尿病模型大鼠。糖尿病模型大鼠高脂高糖飼料飼喂4周后給予普通飼料飼養(yǎng)，正常對照組大鼠給予常規(guī)飼料飼養(yǎng)，每周記錄大鼠攝食量、飲水量、體重及血糖水平，參照文獻(xiàn)[6]對糖尿病模型大鼠進(jìn)行DR模型評價。

1.2.2 動物分組及處理 經(jīng)檢測證實，本研究共計50只大鼠造模成功。采用隨機數(shù)字表法分為模型組、羥苯磺酸鈣組和明目地黃丸低、中、高劑量組，每組10只，另設(shè)正常對照組。明目地黃丸低、中、高劑量組每天按時予明目地黃丸150、300、600 mg/（kg·d）灌胃治療；羥苯磺酸鈣組予羥苯磺酸鈣150 mg/（kg·d）灌胃治療；正常對照組及模型組予等量生理鹽水灌胃，藥物處理期間，第4、8、10周定期檢測大鼠體重及血糖水平。灌胃給藥10周后，給予大鼠2.5%戊巴比托腹腔注射麻醉，腹主動脈取血至動物休克，迅速取出大鼠的眼球視網(wǎng)膜組織，分成3份，一份置于4%多聚甲醛中固定，制備石蠟切片，用于HE染色；一份置于4%戊二醛中固定，用于病理形態(tài)學(xué)觀察；一份置于液氮中速凍，-70℃保存。

1.2.3 蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察視網(wǎng)膜形態(tài) 對“1.2.2”項中大鼠視網(wǎng)膜組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化處理。按照HE法染色流程對切片進(jìn)行染色，中性膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下，觀察大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)并拍照。

1.2.4 透射電子顯微鏡（TEM）觀察視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞自噬 將“1.2.2”項中4%戊二醛固定的大鼠視網(wǎng)膜組織，按照文獻(xiàn)[7]中的方法制備透射電鏡標(biāo)本。置于透射電子顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞自噬小體并拍照。每個視網(wǎng)膜組織標(biāo)本隨機選取10個視野，計數(shù)自噬小體的數(shù)量并進(jìn)行比較。

1.2.5 蛋白印記（Western blot，WB）法檢測微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Beclin、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)水平 將“1.2.2”項中大鼠視網(wǎng)膜冷凍組織在液氮中研磨，加入1.2 mL蛋白裂解液（含protease inhibitor），提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總量。SDS-凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；5%脫脂奶粉，封閉1 h；分別加入一抗Anti-Beclin、Anti-LC3-Ⅱ、Anti-p-Akt、Anti-Akt、Anti-p-mTOR、Anti-mTOR、Anti-GAPDH（1∶500），4℃孵育過夜；加入二抗（1∶5000），室溫孵育1 h。經(jīng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測，Tanon軟件拍攝圖像并進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行S-N-K法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 明目地黃丸對大鼠體重、血糖的影響

藥物處理前，模型組大鼠體重、血糖水平均顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；模型組、羥苯磺酸鈣組和明目地黃丸低、中、高劑量組大鼠體重、血糖水平之間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。藥物處理10周后，與模型組比較，羥苯磺酸鈣組和明目地黃丸低、中、高劑量組大鼠體重、血糖水平無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 明目地黃丸對大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示，正常對照組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，細(xì)胞排列規(guī)則有序；與正常對照比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織現(xiàn)空泡樣變化，細(xì)胞排列稀疏紊亂，毛細(xì)血管擴張充血明顯；藥物作用10周后，明目地黃丸低、中、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)完整，細(xì)胞排列基本規(guī)則，可見少量毛細(xì)血管擴張充血。

2.3 明目地黃丸對大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞自噬的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中自噬小體數(shù)量明顯減少（P < 0.05）；藥物作用10周后，與模型組比較，明目地黃丸低、中、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織中自噬小體數(shù)量顯著增加（P < 0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。見圖2、表2。

2.4 明目地黃丸對大鼠視網(wǎng)膜組織中LC3-Ⅱ、Beclin蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中LC3-Ⅱ、Beclin蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；藥物作用10周后，與模型組比較，明目地黃丸低、中、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織中LC3-Ⅱ、Beclin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P < 0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。見圖3、表3。

2.5 明目地黃丸對大鼠視網(wǎng)膜組織中Akt-mTOR信號通路的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中Akt、mTOR蛋白表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。藥物作用10周后，與模型組比較，明目地黃丸低、中、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織中Akt、mTOR蛋白表達(dá)水平無明顯變化（P > 0.05），p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P < 0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。見圖4、表4。

3 討論

糖尿病患者的視網(wǎng)膜組織長期處于高糖環(huán)境中，血-視網(wǎng)膜屏障受到損傷，導(dǎo)致毛細(xì)血管基底膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖，血管內(nèi)皮細(xì)胞連接減弱，伸縮性降低，通透性增高，導(dǎo)致毛細(xì)血管閉塞，加劇糖尿病患者視網(wǎng)膜病變[8-10]。明目地黃丸因其養(yǎng)肝、滋腎、明目等作用，被廣泛應(yīng)用于治療各種眼科疾病、腦血管病、糖尿病等內(nèi)分泌疾病疾病[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模期間，模型組大鼠體重明顯降低，血糖顯著升高。明目地黃丸干預(yù)10周后，與模型組比較，明目地黃組大鼠體重、血糖水平無顯著變化，提示明目地黃丸無顯著降血糖作用。視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果顯示，明目地黃丸干預(yù)后，不同程度地減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織病理損傷，不同程度地改善毛細(xì)血管充血情況，細(xì)胞排列逐漸規(guī)則，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)趨于完整，提示明目地黃丸通過改善視網(wǎng)膜微循環(huán)，促使視網(wǎng)膜血流通暢，而達(dá)到減輕或清除視網(wǎng)膜毛細(xì)血管滲漏和視網(wǎng)膜水腫的目的，從而實現(xiàn)對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織損傷的保護作用，改善視網(wǎng)膜病變。

自噬是真核細(xì)胞特有的一種防御保護機制，自噬在應(yīng)對細(xì)胞氧化應(yīng)激及機體能量失衡導(dǎo)致的高胰島素血癥等生物過程中發(fā)揮重要作用，高糖高脂環(huán)境導(dǎo)致自噬作用的抑制，參與2型糖尿病和DR的發(fā)生[12-13]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）是一種重要的自噬相關(guān)蛋白，當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3-Ⅰ負(fù)責(zé)招募自噬相關(guān)蛋白至自噬小體，LC3-Ⅱ則始終定位在自噬體膜的表面，因此LC3-Ⅱ可作為細(xì)胞自噬開始的標(biāo)志物，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞自噬程度[14]。Beclin 1蛋白可結(jié)合PI3K、Vps34等自噬相關(guān)蛋白形成復(fù)合物，參與調(diào)解自噬小體的形成，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，因此Beclin 1是一種調(diào)控自噬的關(guān)鍵蛋白[15]。Dehdashtian等[16]發(fā)現(xiàn)，自噬、氧化應(yīng)激、炎癥及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的主要致病因素，可導(dǎo)致線粒體中電子傳遞鏈障礙、細(xì)胞中活性氧累積，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管黏附等病變。本研究發(fā)現(xiàn)，DR模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中自噬小體數(shù)量顯著低于正常對照組，明目地黃丸干預(yù)10周后，DR大鼠視網(wǎng)膜組織中自噬小體數(shù)量顯著增加，呈劑量依賴效應(yīng)。進(jìn)一步研究顯示，DR模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和Beclin蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，明目地黃丸干預(yù)10周后，LC3-Ⅱ、Beclin蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，呈劑量依賴效應(yīng)。以上結(jié)果提示，高糖可誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞自噬功能障礙和溶酶體損傷，導(dǎo)致有害物在細(xì)胞內(nèi)積累，抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)和自噬小體的形成，導(dǎo)致DR的發(fā)生，而明目地黃丸則可逆轉(zhuǎn)這一抑制作用，促進(jìn)自噬小體的形成，提示明目地黃丸對DR的修復(fù)作用可能與細(xì)胞自噬有關(guān)。

Akt/mTOR信號通路是由激酶級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt通過協(xié)同磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶作用，促進(jìn)Akt由胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，發(fā)生磷酸化而激活，激活的Akt可進(jìn)一步促進(jìn)其下游蛋白mTOR的磷酸化，從而激活靶基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞分化、凋亡、自噬、血管形成等生理過程[17-18]。Poornima等[19]研究證實，荷花堿可劑量依賴地抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的自噬作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中Akt、mTOR蛋白總表達(dá)情況無明顯變化，但p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)；明目地黃丸治療后p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，對Akt、mTOR蛋白總量沒有影響，提示明目地黃丸具備抑制Akt-mTOR信號通路的可能，推測明目地黃丸可能通過抑制Akt-mTOR信號通路，促進(jìn)細(xì)胞自噬，發(fā)揮對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的修復(fù)作用。

綜上所述，明目地黃丸可能通過抑制Akt-mTOR信號通路促進(jìn)自噬小體形成，發(fā)揮對糖尿病所致視網(wǎng)膜損傷的保護作用。

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