eNOS對糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究進(jìn)展

汪權(quán)志+夏媛玲

摘要：糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy ，DR）是糖尿病在眼部常見并發(fā)癥，微血管的病變導(dǎo)致相關(guān)并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者視覺和生活質(zhì)量。而內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）作為血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝中的限速酶，在糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy ，DR）疾病進(jìn)展中可能有一定的作用。本文對內(nèi)皮型一氧化氮合酶在糖尿病視網(wǎng)膜病變研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：糖尿病視網(wǎng)膜病變； 內(nèi)皮型一氧化氮合酶 ；血管內(nèi)皮生長因子

Research Progress of Endothelial Nitric Oxide Synthase on Diabetic Retinopathy

WANG Quan-zhi1，XIA Yuan-ling2

（1.Guizhou Medical University，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.Ophthalmology Department，The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550000，Guizhou，China）

Abstract：Diabetic retinopathy is a common complication of diabetes in the eye， microvascular disease-related complications seriously affect the patient's visual and quality of life. Endothelial nitric oxide synthase， a rate-limiting enzyme in the metabolism of vascular endothelial cells， may play a role in the progression of diabetic retinopathy. This review summarizes the progress of endothelial nitric oxide synthase in diabetic retinopathy.

Key words：Diabetic retinopathy；Endothelial nitric oxide synthase （eNOS）；Vascular endothelial growth factor

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）在人群中發(fā)病率逐年增高，據(jù)一項對751個數(shù)據(jù)的研究分析，到2014年全球糖尿病患病率達(dá)到4.22億[1]。目前認(rèn)為DR發(fā)病的危險因素主要包括年齡、血糖水平、血壓水平、胰島素使用及遺傳等因素。DR在眼部常見于視網(wǎng)膜血管改變，繼而導(dǎo)致一系列眼部并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜新生血管、視網(wǎng)膜黃斑水腫、眼底出血、視網(wǎng)膜脫離、新生血管性青光眼等嚴(yán)重危害患者視力，降低患者生活質(zhì)量并帶來一定的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[2]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS） 存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是產(chǎn)生一氧化氮（nitric oxide，NO）的限速酶，而NO作為重要的血管調(diào)控因子，在DR進(jìn)展中占有一定地位，現(xiàn)就eNOS在DR研究做一綜述。

1 eNOS及NO的作用

正常生理情況下 NOS是一組同工酶，根據(jù)其不同的蛋白結(jié)構(gòu)和mRNA 表達(dá)的組織特異性分為3種亞型：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）[2]。其中eNOS基因位于7號染色體（7q35 36），含有26個外顯子，長達(dá)21kb，編碼的mRNA 包括了4，052個核苷酸[3]。經(jīng)典理論認(rèn)為，eNOS需要與鈣調(diào)蛋白結(jié)合變構(gòu)之后才能活化，而后者需要在Ca2+濃度升高的條件下才能發(fā)生變構(gòu)與eNOS結(jié)合。eNOS以左旋精氨酸（L-Arg）為底物，在NOS催化下生成NO參與維持循環(huán)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)平衡。NO在體內(nèi)能夠維持血管的張力、微血管的完整性及通透性，且具有很強的抗血小板聚集和預(yù)防血栓形成的作用。許多心血管系統(tǒng)疾病，如高血壓、動脈粥樣硬化等都與內(nèi)皮功能紊亂致NO的合成障礙密切相關(guān)。

2 eNOS基因在DR中的表現(xiàn)

糖尿病長期高血糖對視網(wǎng)膜微血管的刺激是DR主要原因，但臨床也有發(fā)現(xiàn)部分患者血糖控制良好但也會發(fā)生DR，而有的患者長期血糖控制不佳卻沒有發(fā)生DR，可能遺傳因素在DR發(fā)展過程起一定作用。eNOS基因可能在體內(nèi)支配DR血管功能調(diào)控起重要作用。AlI MoMenI 等[4]在一項橫斷面調(diào)查研究中，對94例2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者與94例正常人血液行eNOS合酶基因型（TT，GT or GG）多樣性分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血液中eNOS合酶基因型多樣性較正常人常見。Cilen？觢ek I等[5]在一項實驗組為172例增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）患者，對照組為405例糖尿病但沒有視網(wǎng)膜病變進(jìn)行eNOS基因的VNTR a/b 多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)攜帶基因型 為4a/4a的個體比基因型 4b/4a和4b/4b 的個體患PDR的風(fēng)險高2.9倍。但佘重陽等[6]在eNOS基因內(nèi)含子的數(shù)目可變串連重復(fù)多態(tài)性一項研究發(fā)現(xiàn)，eNOS基因VNTR 4a/b多態(tài)性4a/b基因型分布DR組（bb 78.5%，ab 21.5%，aa0.0%）與DWR組（bb 77.7%，ab 21.6%，aa0.7%）相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.88，P=0.643）。在一項eNOS基因 a/b 多態(tài)性與DR關(guān)系多數(shù)據(jù)的Meta分析中，DR發(fā)病總體易感性與eNOS 基因 a/b 多態(tài)性無相關(guān)性，但在種族上分析中發(fā)現(xiàn)，eNOS 基因 a/b 多態(tài)性可能在非洲人群DR起重要作用[7]。

有研究顯示糖尿病合并視網(wǎng)膜病變和糖尿病無病變患者中發(fā)現(xiàn)eNOS的基因多態(tài)性在第4內(nèi)含子中無顯著差異性[8]。Li Q等[9]在一項以小鼠被敲掉eNOS基因并被鏈脲霉素（streptozotocin STZ）誘導(dǎo)成糖尿病的試驗研究中，發(fā)現(xiàn)eNOS介導(dǎo)內(nèi)皮衍生的NO的缺乏，伴隨iNOS的活化，可以產(chǎn)生更多NO，當(dāng)遇到活性氧時，可以產(chǎn)生高度活性的氮物質(zhì)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，和加速的視網(wǎng)膜病變。

3 eNOS在DR眼部表現(xiàn)

糖尿病是一種以慢性高血糖為特征性表現(xiàn)的代謝性疾病，由于糖代謝紊亂可引起多系統(tǒng)、器官的損害。長期的高血糖刺激可引起眼睛多種組織的解剖功能及結(jié)構(gòu)障礙。eNOS在眼球各層組織結(jié)構(gòu)，如視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維和血管細(xì)胞、色素上皮細(xì)胞、虹膜等中均廣泛存在，在其介導(dǎo)的血管舒張功能下降、血管通透性增加、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞脫落等病理損傷中起著重要作用。

3.1 eNOS在DR房水中特點 Sevsen Kulaks等[10]在一 項前瞻性的研究中，對患有白內(nèi)障的35例增殖期2型糖尿病視網(wǎng)膜病變實驗組與35例年齡和性別匹配對照組研究中，發(fā)現(xiàn)增殖期糖尿病視網(wǎng)膜患者房水中NO濃度與對照組有顯著差異，然而增殖期糖尿病視網(wǎng)膜患者血清中NO濃度與對照組無明顯差異。已有研究表明羥基-L-精氨酸（HOArg）是生成 NO底物。Hattenbach，L-0等[11]在一項研究中發(fā)現(xiàn)，房水中HOArg水平在非糖尿病和糖尿病受試者中比較，HOArg在糖尿病患者中顯示出顯著更高的水平，眼內(nèi)NO產(chǎn)生的控制可能構(gòu)成糖尿病性視網(wǎng)膜病變中的潛在治療方法。

3.2 eNOS在DR白內(nèi)障中的表現(xiàn) 研究發(fā)現(xiàn)多元醇代謝路徑是糖尿病中并發(fā)白內(nèi)障重要機制，糖尿病引起晶狀體的高糖環(huán)境導(dǎo)致多元醇在晶狀體內(nèi)蓄積引起糖性白內(nèi)障。蘇文成等[12]在研究糖尿病對白內(nèi)障作用機制中，發(fā)現(xiàn)糖尿病合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障組房水中NO含量較單純年齡相關(guān)性白內(nèi)障組高，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。

張筠等[13]在研究NOS抑制劑（硝基左旋精氨酸甲酯L-NAME）對半乳糖白內(nèi)障小鼠防治作用中，隨機分為對照組、模型組、L-NAME組3個組，每組各20只，模型組、L-NAME組給予50%D一半乳糖溶液，L-NAME組同時用L-NAME滴眼液點眼。30 d后摘除晶狀體并行實驗分析。與對照組比較，后兩組NO含量明顯升高，模型組晶狀體NO含量較L-NAME組高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。在NOS分析中模型組含量明顯高于對照組，L-NAME組大鼠亦高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義?？赡躤NOS通過房水在糖尿病患者中介導(dǎo)白內(nèi)障的進(jìn)展中有一定作用。

3.2 eNOS在DR玻璃體中表現(xiàn) PDR由于局部缺血缺氧致病理性血管在視網(wǎng)膜中生成，新生的血管脆性和穩(wěn)定性都較生理性血管差，易導(dǎo)致視網(wǎng)膜病理性出血聚集玻璃體中，玻璃體血液機化，容易牽拉致視網(wǎng)膜脫離。以18例PDR患者并發(fā)視網(wǎng)膜脫離行玻璃體切除術(shù)作為實驗組，15例尸體和3例黃斑裂孔眼行玻璃體切除術(shù)為對照組，發(fā)現(xiàn)實驗組玻璃體中NO含量較對照組高[14]。Diederen RM等[15]通過NO代謝途徑中的底物來研究NO在PDR患者中作用，通過手術(shù)過程取患者玻璃體來分析，發(fā)現(xiàn)NO合成途徑的底物精氨酸在PDR組較對照組升高，有統(tǒng)計學(xué)差異。Gao L等[16]在研究NO含量在PDR患者玻璃體中病理改變，考慮到NO生物活性半衰期較短，用硝酸鹽間接來測量其含量。取27例PDR需行玻璃體切除術(shù)和35例沒有糖尿病但須玻璃體切除術(shù)玻璃體液分析，結(jié)果硝酸鹽在PDR組較對照組玻璃體含量高（41.17±4.09μM vs. 15.22±0.86μM，P=0.000001），有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，間接說明NO在DR中玻璃體病變有著密切關(guān)聯(lián)。而病理性新生血管在DR中常見，eNOS可能在PDR通過NO的介導(dǎo)在玻璃體中高表達(dá)。

3.3 eNOS與VEGF在DR中關(guān)系

3.3.1 VEGF在DR中作用 DR由于持續(xù)高血糖及其他相關(guān)因素的刺激，導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管發(fā)生一系列改變，以視網(wǎng)膜毛細(xì)血管網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞損害為主要病理改變。如視網(wǎng)膜微動脈瘤 、滲出、棉絨斑等，由于局部血管組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血缺氧，進(jìn)而促進(jìn)新生血管的生成，而VEGF作為促血管生成因子，在DR演變中有重要作用。

Wakabayashi Y等[17]在一項檢測52例PDR行玻璃體切除術(shù)后VEGF水平中，發(fā)現(xiàn)術(shù)后玻璃體和房水中VEGF濃度升高與并發(fā)玻璃體出血和新生血管性青光眼有關(guān)。武淑玲等[18]在一項臨床試驗研究中，試驗組為40例PDR，對照組為40例年齡相關(guān)性白內(nèi)障外無全身其他疾病患者，分別檢測玻璃體、房水、血漿中 VEGF、t-PA、PAI濃度，發(fā)現(xiàn)PDR組玻璃體、房水中VEGF濃度較對照組升高，有顯著差異。在一項印度人群中的研究中，探索VEGF 與 eNOS在DR和糖尿病不合并病視網(wǎng)膜病變作用，發(fā)現(xiàn)VEGF的5'UTR和啟動子區(qū)的多態(tài)性在DR遺傳中有一定作用[8]。

Abu El-Asrar AM[19]等在研究增殖期DR患者玻璃體血管生成觸發(fā)因素中，實驗組為34例PDR患者，其中23例患者并發(fā)視網(wǎng)膜脫離，13例患者合并玻璃體出血，對照組為15例孔源性視網(wǎng)膜脫離但沒有合并增值性玻璃體視網(wǎng)膜病變，在行玻璃體手術(shù)過程中取2組玻璃體進(jìn)行分析，sVEGFR-2在實驗組較對照組有明顯升高。Maugeri G等[20]在用人的REP細(xì)胞在高糖的微環(huán)境中模擬糖尿病黃斑水腫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide（PACAP）and vasoactive intestinal peptide（VIP）能通過升高HIF-3α來降低HIF-1α從而來降低VEGF，從而保護(hù)黃斑水腫。DME和PDR作為DR常見并發(fā)癥，在人群的研究表明，約1/3的糖尿患者群具有DR的跡象，并且約1/10有DME或PDR等并發(fā)癥而威脅到視覺[21]?？梢奦EGF在介導(dǎo)以上兩種并發(fā)癥中扮演著重要作用。

3.3.2 eNOS與VEGF Youde Jiang等[22]在關(guān)于Compound49b（一種β-腎上腺素能受體激動劑）在減少1型糖尿病視網(wǎng)膜病變模型的小鼠VEGF水平研究中，通過誘導(dǎo)小鼠為糖尿病鼠，取小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行不同物質(zhì)對比分析，得出Compound 49b是通過增加IGFBP-3來減少VEGF的水平，而IGFBP-3主要通過在調(diào)控eNOS，PKCζ和PKCδ途徑來實現(xiàn)。Koai E等[23]在 血管內(nèi)皮生長因子是否改變內(nèi)皮一氧化氮合酶轉(zhuǎn)錄研究中結(jié)果表明：VEGF在eNOS-mRNA上升之前快速激活eNOS轉(zhuǎn)錄。Qiuhua Zhang等[24]探索insulin-like growth factor binding protein-3（IGFBP-3）如何在糖尿病中降低 VEGF過程中，用人的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞分別在正常葡萄糖和高濃度葡萄糖下培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)染IGFBP-3 NB 質(zhì)粒，分析PKCzeta、eNOS和VEGF之間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)eNOS被抑制在這個過程中起著重要作用。

García C等[25]在一項研究發(fā)現(xiàn)Vasoinhibins在阻止DR的過程是通過抑制eNOS磷酸化，來降低VEGF的水平。梅開等[26]也在eNOS在影響腫瘤血管生成的研究中，也發(fā)現(xiàn)eNOS在抑制VEGF進(jìn)而影響腫瘤血管的生成?？梢奺NOS與VEGF相互作用，共同調(diào)控機體血管的生成。在PDR期視網(wǎng)膜血管供氧障礙導(dǎo)致新生異常血管引起眼內(nèi)一系列并發(fā)癥，如眼底出血、視網(wǎng)膜脫離、新生血管性青光眼等影響患者視力，如果在進(jìn)行eNOS的靶向治療可能會抑制DR的進(jìn)展。

4 總結(jié)與展望

隨著人們生活水平的提高，DR發(fā)病率越來越高，對人們視覺質(zhì)量有重要的相關(guān)性?，F(xiàn)階段對DR的研究，特別是分子水平的研究越來越深入，關(guān)于其病理機制及各種促進(jìn)因素將逐步被揭曉。eNOS在DR進(jìn)展中具有重要作用，eNOS在DR的中作用機制復(fù)雜，可能與VEGF共同作用促進(jìn)新生血管增生及視網(wǎng)膜黃斑水腫等相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生。在并發(fā)玻璃體病變中NO可能與eNOS存在某種聯(lián)系，有待研究進(jìn)一步的深入。糖尿病并發(fā)白內(nèi)障發(fā)病率明顯較普通白內(nèi)障發(fā)病率高，eNOS也可能在其中發(fā)揮重要作用。關(guān)于eNOS基因研究，世界不同地區(qū)、種族有所差異，相信隨著研究樣本數(shù)量的增加，人們對eNOS基因在DR中作用會更加明朗。對DR的研究還任重道遠(yuǎn)，eNOS與糖尿病的眼部并發(fā)癥均有明顯聯(lián)系，可能不久的將來會成為糖尿病眼部并發(fā)癥預(yù)防和治療的研究熱點。

參考文獻(xiàn)：

[1]ZhouB， Lu Y， Hajifathalian K， et al.Worldwide trends in diabetes since 1980： a pooled analysis of 751 population-based studies with 4·4 million participants[J].Lancent，2016，100387（27）：1513-1530.

[2]Billiar TR.Nitric oxide.Novel biology with clinical relevance[J].Ann Surg，1995 ，221（4）：339-349.

[3]Marsden PA， Heng HH， Scherer SW，et al. Structure andchromosomal localization of thehuman constitutive endothelial nitricoxide synthase gene[J]. J Biol Chem ，1993，268：17478-17488.

[4]Momeni A， Chaleshtori MH， Saadatmand S， et al.Correlation of Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene Polymorphism （GG， TT and GT Genotype） withProteinuria and Retinopathy in Type 2 Diabetic Patients[J].J Clin Diagn Res，2016 ，10（2）：32-35.

[5]Cilenek I1，Manko S，Globonik Petrovi M，et al.GSTT1 nullgenotype is a risk factor for diabetic retinopathy in Caucasians with type 2 diabetes， whereas GSTM1 null genotype might confer protection against retinopathy[J].Dis Markers，2012， 32（2）： 93-99.

[6]佘重陽，楊秀芬，顧虹，等.內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因內(nèi)含子的數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性研究[J].中華眼科雜志，2015，51（5）：338-343.

[7]曾正洪，鐘莉，王敏，等.內(nèi)皮型一氧化氮合酶（ eNOS ）基因 a/b 多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病易感性的Meta 分析[J].中國循證醫(yī)學(xué)雜志，2015，15（8）： 898-906.

[8]Suganthalakshmi B， Anand R， Kim R， et al.Association of VEGF and eNOS gene polymorphisms in type 2 diabetic retinopathy[J].Mol Vis， 2006 ，12：336-341.

[9]Li Q1， Verma A， Han PY，et al.Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy[J].Invest Ophthalmol Vis Sci， 2010，51（10）：5240-5246.

[10]Kulaksizoqlu S， Karalezli A.Aqueous Humour and Serum Levels of Nitric Oxide， Malondialdehyde and Total Antioxidant Status in Patients with Type 2 Diabetes with Proliferative Diabetic Retinopathy and Nondiabetic Senile Cataracts[J].Can J Diabetes，2016，40（2）：115-119.

[11]Hattenbach LO， Allers A， Klais C， et al.L-arginine-nitric oxide pathway-related metabolites in the aqueous humor of diabetic patients[J].Invest Ophthalmol Vis Sci， 2000 ，41（1）：213-217.

[12]蘇文成，楊煒，邱明磊，等.糖尿病老年性白內(nèi)障血清、房水中一氧化氮與抗氧化能力的改變[J].石河子大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，5（7）；599-601.

[13]張筠，何靜，閏志鵬，等.一氧化氮合酶抑制劑對大鼠半乳糖性白內(nèi)障的防治作用[J].中華實驗眼科雜志，2013，31（4）：334-338.

[14]Yilmaz G， Esser P， Kociok NAm，et al.Elevated vitreous nitric oxide levels in patientswith proliferative diabetic retinopathy[J].Am J Ophthalmol， 2000 ，130（1）：87-90 .

[15]Diederen RM， La Heij EC， Deutz NE，et al.Increased nitric oxide （NO） pathway metabolites in the vitreous fluid of patients with rhegmatogenous retinal detachmentor diabetic traction retinal detachment[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol， 2006，244（6）：683-688.

[16]Gao L， Pulido JS， Hatfield RM，et al.Capillary electrophoretic assay for nitrate levels in the vitreous of proliferative diabetic retinopathy[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2007，847（2）：300-304.

[17]Wakabayashi Y1， Usui Y， Okunuki Y， et al.Immune mediators in vitreous fluids from patients with vitreoretinal B-cell lymphoma[J].Invest Ophthalmol Vis Sci， 2012，53（9）：5395-5402.

[18]武淑玲，何香蓮.PDR患者血漿及眼內(nèi)組織VEGF的表達(dá)與t-PA及PAI表達(dá)的相關(guān)性研究[J].中華眼科雜志，2014，50（6）：448-453.

[19]Abu El-Asrar AM1， Nawaz MI， Kangave D， et al.Angiogenic and vasculogenic factors in the vitreous from patients with proliferative diabetic retinopathy[J].J Diabetes Res， 2013，2013：539-658.

[20]Maugeri G， Grazia D'Amico A， Reitano R，et al.PACAP and VIP Inhibit the Invasiveness of Glioblastoma Cells Exposed to Hypoxia through the Regulation of HIFs and EGFR Expression[J].Front Pharmacol， 2016 ，7：139.

[21]Lamoureux EL， Wong TY.Diabetic Retinopathy in 2011： Further Insights From New Epidemiological Studies and Clinical Trials[J].Diabetes Care， 2011，34（4）：1066-1067.

[22]Jiang Y， Zhang Q， Steinle JJ.Beta-adrenergic receptor agonist decreases VEGF levels through altered eNOS and PKC signaling in diabetic retina[J].Growth Factors， 2015，33（3）：192-199.

[23]Koai E， Rios TR， Edwards J.Vascular Endothelial Growth Factor Increases EndothelialNitric Oxide Synthase Transcription In Huvec Cells[J].Webmedcentral， 2010，1（11）.

[24]Zhang Q1， Jiang Y2， Steinle JJ.IGFBP-3 reduces eNOS and PKCzeta phosphorylation， leading to lowered VEGF levels[J].Mol Vis， 2015 ，21：604-611.

[25]García C， Aranda J， Arnold E，et al.Vasoinhibins prevent retinal vasopermeability associated with diabetic retinopathy in rats via protein phosphatase 2A-dependent eNOS inactivation[J]. J Clin Invest， 2008 ，118（6）：2291-2300.

[26]梅開，蔡曉虹，杜磊，等.內(nèi)皮型一氧化氮合酶來源的NO調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成[J].癌癥，2010 ，29，（1 ）：32-37.

編輯/金昊天