TMPRSS4在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

趙雪峰，趙美蘭，許廣大

（大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 1. 普通外科；2. 藥劑科，遼寧 大連 116021）

多學(xué)科綜合治療模式在胃癌診治的實(shí)際應(yīng)用中暴露出基礎(chǔ)與臨床結(jié)合研究不足的缺點(diǎn)，而且目前對(duì)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究也寥寥無(wú)幾［1］。因此，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究間需要建立有效的溝通，尤其要關(guān)注基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究成果向臨床醫(yī)學(xué)快速轉(zhuǎn)化，以便用最簡(jiǎn)單、有效的手段確立胃癌高水準(zhǔn)的診治模式。眾所周知，侵襲和轉(zhuǎn)移是影響胃癌治療效果和預(yù)后的關(guān)鍵要素［2］。值得說(shuō)明的是，TMPRSS4在諸多腫瘤中與侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，但在胃癌的研究報(bào)道不多［3］。本研究首先采用實(shí)時(shí)PCR方法，在RNA或DNA水平上檢測(cè)正常黏膜和胃癌組織的TMPRSS4表達(dá)；而后采用免疫組織化學(xué)方法，在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)正常胃黏膜、胃腺瘤、原發(fā)胃癌及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶組織的TMPRSS4表達(dá)；最后結(jié)合臨床病理和隨訪資料分析，評(píng)估TMPRSS4能否成為預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2016年12月大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院普通外科胃癌手術(shù)的30例相對(duì)正常胃黏膜和30例胃癌組織新鮮標(biāo)本，行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)TMPRSS4表達(dá)前，標(biāo)本取材后保存在液氮中。再選取2008年1月至2014年12月在我院行胃癌手術(shù)或胃息肉EMR/ESD術(shù)后蠟塊標(biāo)本，備行免疫組織化學(xué)檢測(cè)TMPRSS4表達(dá)，包括30例相對(duì)正常胃黏膜、18例胃腺瘤、122例原發(fā)胃癌及22例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶組織。122例原發(fā)胃癌中男性80例，女性42例；年齡范圍31～79歲，中位年齡63.5歲；腫瘤大小＜4.0 cm 69例，≥4.0 cm 53例；TNM分期I期41例，Ⅱ期28例，Ⅲ期31例，Ⅳ期22例。22例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶分別為：第12a組淋巴結(jié) （LN#12a） 及以上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例；其他臟器或組織 （肝臟、肺、腹膜等） 轉(zhuǎn)移12例。病例排除標(biāo)準(zhǔn)： （1）新輔助放化療者； （2） 同時(shí)性多原發(fā)胃癌者； （3） 合并其他惡性腫瘤者； （4） 患有活動(dòng)性結(jié)締組織病者；（5） 針對(duì)腫瘤特殊治療或非初治者； （6） 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶未能切除或活檢者； （7） 門(mén)診或電話(huà)隨訪失聯(lián)者。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)：cDNA合成后，進(jìn)入實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系。TMPRSS4mRNA上游引物 序列5’-CCGATGTGTTCAACTGGAAG-3’，下游引物序列5’-CCCATCCAATGATCCAGAGT-3’； 而GAPDH上游引物 序列5’-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3’，下游引物序列5’-ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT-3’。反應(yīng)條件：94 ℃ 10 s，62 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判定采用LogRQ法進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)及評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：采用Polymer Kit （非生物素） 二步法檢測(cè)TMPRSS4 （Protein Tech公司） 表達(dá)，其中TMPRSS4工作濃度為1∶50過(guò)夜，并選PBS作為陰性對(duì)照。根據(jù)細(xì)胞染色比例分為：0 （染色細(xì)胞比例≤5%） ，1 （染色細(xì)胞比例＞5%～25%） ，2 （染色細(xì)胞比例＞25%～50%） ，3 （染色細(xì)胞比例＞50%） ；根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度分為：0 （未染色） ，1 （輕度染色、淺黃色） ，2 （中度染色、棕黃色） ，3 （重度染色、棕色） 。染色指數(shù)=細(xì)胞染色比例×細(xì)胞染色強(qiáng)度，分別標(biāo)記為0、1、2、3、4、6及9。當(dāng)染色指數(shù)≥6時(shí)，認(rèn)為T(mén)MPRSS4表達(dá)呈陽(yáng)性，反之為陰性。

1.2.3 觀察指標(biāo)： （1） 癌與非癌組織中的TMPRSS4表達(dá)； （2） TMPRSS4表達(dá)水平與原發(fā)性胃癌指標(biāo)；（3） TMPRSS4表達(dá)水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶指標(biāo)； （4） TMPRSS4表達(dá)水平與隨訪指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組臨床病理因素比較采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)；多變量分析采用Cox 回歸分析；原發(fā)腫瘤與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的TMPRSS4表達(dá)相關(guān)性分析采用線性回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMPRSS4在胃癌組織和非癌組織中的表達(dá)

實(shí)時(shí) PCR檢測(cè)結(jié)果，TMPRSS4表達(dá)在胃癌組織中顯著高于相對(duì)正常胃黏膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.035） ，見(jiàn)圖1。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果，TMPRSS4表達(dá)在原發(fā)胃癌及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組織中顯著高于非癌組織，隨著臨床分期的增長(zhǎng)其表達(dá)呈逐漸升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.01） ，見(jiàn)圖2、3。

圖1 胃癌組織與相對(duì)正常胃黏膜間TMPRSS4表達(dá)比較Fig.1 Relative expression of TMPRSS4 in gastric cancer tissues compared with adjacent normal mucosal tissues

圖2 癌與非癌組織的TMPRSS4免疫組織化學(xué)染色Fig.2 TMPRSS4 immunohistochemical staining in cases of human gastric cancers and noncancers

圖3 癌與非癌的TMPRSS4表達(dá)盒形圖Fig.3 Boxplot analysis of TMPRSS4 expression levels in cases of human gastric cancer and non-cancer

2.2 TMPRSS4表達(dá)與胃癌臨床病理因素間的關(guān)系

TMPRSS4高表達(dá)與腫瘤大小、淋巴血管浸潤(rùn)、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān) （P＜ 0.05） ，見(jiàn)表1。多變量Cox回歸分析顯示，TMPRSS4高表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素 （HR= 2.72，P= 0.005） ，見(jiàn)表2。線性回歸分析顯示，原發(fā)腫瘤的TMPRSS4表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的TMPRSS4表達(dá)呈正相關(guān) （β= 0.307，R2=0.143，P=0.025） 。

表1 TMPRSS4表達(dá)與臨床病理特征Tab.1 Clinicopathological characteristics of patients with versus without TMPRSS4 expression

表2 胃癌預(yù)后影響因素的單變量與多變量分析Tab.2 Univariate and multivariate analyses of prognostic factors of gastric cancer

3 討論

TMPRSS4是新型絲氨酸蛋白酶，也是分泌型蛋白水解酶，其生物學(xué)特性及腫瘤演進(jìn)中的作用機(jī)制尚未完全清楚，但在上皮細(xì)胞來(lái)源的胰腺癌、甲狀腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌及胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用漸漸得到了相應(yīng)的肯定［4-6］。因?yàn)門(mén)MPRSS4具有多種結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和水解蛋白酶特性，其可與多種成分發(fā)生反應(yīng)、凝聚成傳導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體，關(guān)聯(lián)到胞內(nèi)、外的多種傳導(dǎo)信號(hào)途徑，且涉及腫瘤增長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等腫瘤發(fā)生、發(fā)展的任何階段［7］。TMPRSS4不僅激活A(yù)DAM受體系統(tǒng)和uPA/uPAR受體系統(tǒng)，還牽連、調(diào)節(jié)FAK、Src、Rac1、Akt、ERK、p38、JNK等諸多傳導(dǎo)信號(hào)途徑，通過(guò)啟動(dòng)ECM的降解來(lái)引發(fā)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［8-9］。

近期研究［10］證實(shí)，TMPRSS4在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于配對(duì)正常的癌旁組織，且在胃癌中的表達(dá)與TNM分期顯著相關(guān)，TMPRSS4陽(yáng)性組5年生存率顯著低于TMPRSS4陰性組；在多變量統(tǒng)計(jì)分析中，發(fā)現(xiàn)TMPRSS4表達(dá)為胃癌預(yù)后的獨(dú)立判定指標(biāo)。此結(jié)論與本研究結(jié)果相一致。本研究選用相對(duì)正常胃黏膜、胃腺瘤、原發(fā)性胃癌及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶組織檢測(cè)了TMPRSS4表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著疾病的進(jìn)展（即正常黏膜、癌前病變、早期癌、進(jìn)展癌、轉(zhuǎn)移癌）TMPRSS4的表達(dá)呈遞增趨勢(shì)。

本研究選用“一患多比”，即同一患者的原發(fā)病灶與轉(zhuǎn)移病灶間的TMPRSS4表達(dá)相互比較、原發(fā)病灶與相對(duì)正常胃黏膜間的TMPRSS4表達(dá)相互比較、轉(zhuǎn)移病灶與正常胃黏膜間的TMPRSS4表達(dá)相互比較。本研究證實(shí)，腫瘤直徑越大、淋巴脈管浸潤(rùn)越多、腫瘤浸潤(rùn)深度越深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位越多TMPRSS4表達(dá)越高，而且其發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移概率會(huì)越高。

近期隨著對(duì)TMPRSS4與腫瘤研究的深入，諸多研究方向的熱點(diǎn)傾向通過(guò)阻斷或抑制TMPRSS4活性來(lái)治療各種惡性腫瘤。研究［11］發(fā)現(xiàn)，采用RNAi技術(shù)可抑制SW1990胰腺癌細(xì)胞的TMPRSS4表達(dá)，還能抑制TMPRSS4沉默細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。TMPRSS4特異性人類(lèi)抗體 （TMPRSS4 specific human antibody，TSHA；專(zhuān)利號(hào)：US 8501175 B2） 的研發(fā)，使得in vivo研究成果指日可待。這也是本研究組將要申報(bào)并完成的課題。

總之，TMPRSS4高表達(dá)可作為評(píng)估胃癌進(jìn)展的新型生物學(xué)指標(biāo)，具有腫瘤生物學(xué)特性的TMPRSS4可能參與腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控。對(duì)TMPRSS4的進(jìn)一步研究將為胃癌的診治提供更加明確的思路與方向。