miR-489抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖

郭冰玉，回薔，常鵬，陶凱

（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院整形外科，沈陽 110840）

隨著分子生物學(xué)的深入研究，人們認(rèn)識(shí)到腫瘤是一種基因相關(guān)疾病，腫瘤患者體內(nèi)往往存在著癌基因的激活以及抑癌基因的失活現(xiàn)象。各種基因的異常表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞逃避正常機(jī)體生理調(diào)控功能，出現(xiàn)增殖異常和凋亡失控等現(xiàn)象。惡性黑色素瘤是一種常見的惡性腫瘤，早期手術(shù)切除及聯(lián)合放化療的綜合治療手段可以使黑色素瘤患者獲得較好的治療效果，但是黑色素瘤通常極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后通常較差。目前已有研究［1-2］表明，黑色素瘤中異常表達(dá)的微小RNA （microRNA，miRNA） 多 達(dá) 數(shù) 十 種，miR-194、miR-204、miR-34和miR-216等在黑色素瘤中的表達(dá)和作用機(jī)制已經(jīng)有了較為深入的研究，它們通過調(diào)控各種與細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等相關(guān)的基因發(fā)揮抑癌或促癌的作用。miR-489已經(jīng)被報(bào)道在膀胱癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤生長和抑制腫瘤遷移的作用［3-4］，但是在黑色素瘤中未見報(bào)道。本研究以人黑色素瘤A375細(xì)胞作為研究對象，探討miR-489對黑色素瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，并進(jìn)一步檢測miR-489對其增殖相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用，為臨床上黑色素瘤的診療提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 材料

人成纖維細(xì)胞細(xì)胞系、黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和A875 （實(shí)驗(yàn)室凍存） ，DMEM培養(yǎng)基 （美國HyClone公司） ，胎牛血清 （天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司） ，miR-489 mimic/control、miR-489 inhibitor/control（廣州銳博生物科技有限公司） ，四甲基偶氮唑藍(lán)、DMSO （上海碧云天生物技術(shù)有限公司） 。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A375細(xì)胞，置5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)：消化培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×104/孔的數(shù)量接種于96孔培養(yǎng)板中，24 h后分別在A375細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-489 mimic/control或者miR-489 inhibitor/control。轉(zhuǎn)染后于0、12、24、36和48 h分別加入10 μ L的5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后使用1 mL注射器吸去上清，每孔中使用200 μ L DMSO溶解結(jié)晶，隨后在490 nm處記錄吸光值。

1.2.3 Western blotting：不同因素處理細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，使用RIPA （上海碧云天） 裂解細(xì)胞提取蛋白。30 μ g蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳 （80～120 V） 、100 V轉(zhuǎn)膜1 h后，室溫封閉2 h。一抗孵育過夜，二抗室溫1 h。CDK2、cyclin E和GAPDH抗體以及相關(guān)二抗均購置于美國SANTA公司。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR：不同因素處理細(xì)胞24 h后，通過TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。所用引物為CDK2，正向5’-GCCATTCTCATC GGGTCCTC-3’，反向5’-ATTTGCAGCCCAGGAGGAT T-3’；cyclin E，正向5’-CCATCATGCCGAGGGAGC-3’，反向5’-AAGGCCGAAGCAGCAAGTAT-3’；GAPDH，正向5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’，反向5’-GC GCCCAATACGACCAAATC-3’。獲取細(xì)胞中miRNA后，用miR-489特異性莖環(huán)引物進(jìn)行miR-489的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。序列如下：5’-CTCATACGGTGTCGTGGA GTCGCATCATGTGAGGCTGCGTT-3’。在miR-489逆轉(zhuǎn)錄后，使用SYBR試劑盒 （日本TaKaRa公司）， 根據(jù)說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測miR-489的表達(dá)。用U6作為對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)分析MTT中不同因素作用于細(xì)胞后的吸光度值與對照組的差異以及不同處理因素作用細(xì)胞后蛋白和mRNA水平與對照組的差異，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-489在細(xì)胞中的表達(dá)情況

分別檢測miR-489在成纖維細(xì)胞、A375細(xì)胞與A875細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-489在黑色素瘤細(xì)胞 （A375和A875） 中的表達(dá)顯著低于成纖維細(xì)胞。見圖1。

圖1 miR-489在細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of miR-489 in cells

2.2 miR-489對A375細(xì)胞增殖的影響

在A375細(xì)胞中過表達(dá)miR-489或者將miR-489表達(dá)下調(diào)后，采用MTT檢測miR-489對A375細(xì)胞的增殖影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-489過表達(dá)后可以顯著抑制A375細(xì)胞的增殖作用，反之，當(dāng)miR-489下調(diào)后，A375細(xì)胞的增殖作用受到促進(jìn)。見圖2。

圖2 miR-489對A375細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of miR-489 on proliferation of A375 cells

2.3 miR-489對增殖相關(guān)蛋白的影響

在A375細(xì)胞中分別將miR-489過表達(dá)或者抑制miR-489表達(dá)24 h后，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，miR-489過表達(dá)可以顯著抑制A375細(xì)胞中CDK2和cyclin E的表達(dá)，反之，miR-489受到抑制后，CDK2和cyclin E的表達(dá)上升。見圖3。

之后采用實(shí)時(shí)PCR檢測miR-489過表達(dá)或受到抑制后CDK2和cyclin EmRNA水平的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-489過表達(dá)可以顯著抑制CDK2和cyclin EmRNA的表達(dá)，反之，miR-489受到抑制后，CDK2和cyclin EmRNA的表達(dá)上升。見圖4。

圖3 Western blotting檢測miR-489對A375細(xì)胞CDK2和cyclin E蛋白水平的影響Fig.3 CDK2 and cyclin E protein in A375 cells detected by Western blotting after treatment with miR-489 mimic/inhibitor

圖4 實(shí)時(shí)PCR檢測miR-489對A375細(xì)胞CDK2和cyclin E mRNA水平的影響Fig.4 CDK2 and cyclin E mRNA in A375 cells detected by real-time PCR after treatment with miR-489 mimic/inhibitor

3 討論

miRNA是長度為18～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。miRNA可以與靶mRNA的3’端非編碼區(qū)域發(fā)生特異性結(jié)合，促使靶蛋白的mRNA發(fā)生降解，或者通過抑制靶蛋白mRNA的翻譯過程來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。目前許多惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有miRNA異常表達(dá)的現(xiàn)象，研究者認(rèn)為miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

黑色素瘤中miR-204-5p可以抑制細(xì)胞增殖、遷移、促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)miR-204-5p可以增加5-氟尿嘧啶和順鉑對惡性黑色素瘤細(xì)胞的化療敏感性；miR-216b可以通過打靶FOXM1抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力；miR-625可以顯著抑制惡性黑色素瘤裸鼠成瘤［2］。以上均說明很多miRNA可能參與黑色素瘤的進(jìn)程。

miR-489已經(jīng)被報(bào)道在多種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。在膀胱癌中miR-489可以通過打靶JAG1來抑制膀胱癌細(xì)胞的生長和遷移作用；miR-489也可以參與調(diào)節(jié)胰腺導(dǎo)管腺癌中的KRAS通路，來發(fā)揮抑制腫瘤的作用；胃癌研究發(fā)現(xiàn)，miR-489可以通過打靶PROX1來發(fā)揮抑癌作用；在乳腺癌中miR-489也通過影響上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程來調(diào)節(jié)乳腺癌的侵襲作用［4-10］。

本研究將黑色素瘤細(xì)胞作為研究對象，通過體外實(shí)驗(yàn)檢測了miR-489對黑色素瘤的調(diào)節(jié)作用。在證明了miR-489在黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)較低后，檢測了miR-489對細(xì)胞的增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-489過表達(dá)后可以顯著抑制A375細(xì)胞的增殖水平（P＜ 0.05） 。隨后的蛋白水平和mRNA水平的檢測發(fā)現(xiàn)，miR-489可以通過抑制CDK2和cyclin E的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對A375細(xì)胞增殖的抑制作用。為了進(jìn)一步明確研究觀點(diǎn)，在A375細(xì)胞中抑制miR-489后進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明miR-489被抑制后，A375細(xì)胞中的CDK2和cyclin E的表達(dá)有所上升，同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-489可以通過抑制一系列細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖的作用，這可能為黑色素瘤的治療提供了新的方向。