趙秋伶， 張振宇， 周廣原， 鄭 昊

(1.遼寧工程技術大學礦業(yè)技術學院，遼寧葫蘆島 125105；2.遼寧工程技術大學電子與信息工程學院，遼寧葫蘆島 125105)

恩諾沙星(Enrofloxacin,ENRX)是一種人工合成的氟喹諾酮類抗菌藥物[1]，被廣泛用于畜牧生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，預防和治療各種動物感染性疾病[2]。ENRX的大量使用造成其在動物源性食品中殘留，威脅人類的身體健康，如可引起神經(jīng)中毒、腎功能損傷、過敏反應等毒副作用，且有潛在的致癌作用，還會使病菌產(chǎn)生耐藥性[3 - 5]。世界各國均對喹諾酮類抗生藥的最高殘留限量(MRL)做出了嚴格限制。我國及美國均規(guī)定，牛、羊的脂肪與肌肉、奶、腎、肝中的MRL分別為100、100、200和300 μg/kg，豬、兔與家禽等其他動物的脂肪與肌肉、肝、腎中的MRL分別為100、200和300 μg/kg[6 - 7]。

目前文獻報道的ENRX殘留檢測方法主要有微生物法、色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、熒光法和分光光度法、毛細管電泳法和免疫學檢測法等[8 - 11]。免疫檢測方法具有快速、靈敏、準確、分析成本底、樣品前處理過程簡單等優(yōu)點，適合大樣品量篩查，因而在實際生產(chǎn)中得到廣泛的應用[12 - 13]?；诤怂徇m配體的酶聯(lián)分析法是一種新型的免疫分析方法[14]，用核酸適配體代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗體發(fā)展檢測方法，可以進一步提高ENRX殘留檢測的靈敏度，另外核酸適配體不受外界環(huán)境的干擾，分析結果重現(xiàn)性高。本研究用自己篩選獲得的ENRX核酸適配體作為識別探針，建立了一種用于檢測動物源性食品中ENRX殘留的競爭取代酶聯(lián)分析方法。研制了ENRX酶聯(lián)分析試劑盒，為ENRX殘留檢測提供一種新的參考方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與材料

Spectra Max Paradigm多功能酶標儀(美國，Molecular Devices公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國,Millipore公司)；Heal Force臺式高速冷凍離心機、微量可調(diào)移液器(德國，Eppendorf公司)。

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、加替沙星、氯霉素、萊克多巴胺(純度>99%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。ENRX核酸適配體序列，3′端生物素(biotin)標記：5′-GAAACGAGGTGCTTGACGGTACGATGTTATACCGGGTTAC-biotin-3′(A1)；和A1部分互補的核酸序列，5′端異硫氰酸熒光素(FITC)標記：5′-FITC-ATTACCGTCAAGCACCTC-3′(B1)；和B1完全互補的核酸序列：5′-biotin-GAGGTGCTTGACGGTAAT-3′(C1)，均購自上海生工生物工程有限公司。Anti-FITC-HRP購自美國Millipore公司；鏈霉親和素修飾的酶標板和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色液購自美國Thermo Scientific公司；恩諾沙星酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒，購自江蘇江萊ELISA研究所；其它試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 試劑盒的組裝

試劑盒組成(96個反應/盒)見表1。使用方法如下：(1)固定DNA：首先向固定磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入A1 200 nmol/L和B1 500 nmol/L，于37 ℃孵育20 min形成部分互補的dsDNA。鏈霉親和素修飾的酶標板用200 μL磷酸鹽-吐溫緩沖液(PBST)洗滌三次，每次5 min。然后在酶標板每孔加入100 μL含A1和B1的dsDNA溶液，置于37 ℃搖床，反應2 h。反應完畢移去反應液，凹槽用PBST洗滌三次，保留待用(凹槽1)。用相同的方法在另一鏈霉親和素修飾的酶標板的凹槽上固定DNA C1(C1的濃度為300 nmol/L)，保留待用(凹槽2)。(2)檢測ENRX：ENRX用結合緩沖液稀釋成不同濃度，加入到待用凹槽1，每口100 μL，室溫反應30 min；反應完畢，用移液器吸出反應液轉(zhuǎn)移到待用凹槽2，37 ℃搖床反應20 min；然后移去反應液，用PBST洗滌三次，每次5 min，每口加100 μL anti-FITC-HRP，37 ℃反應30 min，移去反應液，洗滌三次，最后加100 μL TMB-H2O2底物顯色液，反應20 min，加25 μL 2 mol/L H2SO4終止反應。反應液由藍變黃，用酶標儀測450 nm波長處的吸光度。

表1 試劑盒的組成

1.3 食品樣本檢測

(1)添加回收實驗：選取新鮮肌肉組織(高效液相色譜法已驗證無ENRX)作為添加回收實驗樣品。其前處理方法如下：稱取均質(zhì)后肌肉組織3份，每份各1 g，置于3個15 mL離心管中，分別添加25、50、100 ng ENRX標準品，靜置10 min后分別加入4 mL超純水，充分振蕩均勻，然后用離心機以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，分別吸取上層清液2 mL于3個10 mL離心管中，加入2 mL正己烷，振蕩10 min，以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，除去上層正己烷層，取下層清液50 μL待測。

(2)實際樣品檢測：從興城南關集貿(mào)市場采集鮮肉樣本，共30份，依照添加回收實驗的處理步驟處理鮮肉樣品。用研制的試劑盒進行檢測，同時用商用的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒做對照和驗證。

2 結果與討論

2.1 檢測策略

核酸適配體A1擁有40個堿基序列，前期的實驗已經(jīng)證明和ENRX作用的結合域包含在5′端的16個堿基里，而非后面的莖-環(huán)序列[15]?；贏1核酸適配體的結合域位于一端且不形成復雜結構的特點，我們設計了競爭取代酶聯(lián)分析檢測策略，見圖1。當A1的3′端生物素標記可以被固定到鏈霉親和素標記的酶標板上。B1共18個堿基，除了5′端的兩個堿基之外，其余16個堿基和A1中5′端的16個堿基互補配對，見圖1中A1和B1粗體部分。B1與A1能形成部分互補的dsDNA，通過雜交作用，B1也被固定到酶標板上。加入ENRX后，由于ENRX同其適配體的親和力大于雙鏈互補力，形成穩(wěn)定的ENRX/aptamer復合物，F(xiàn)ITC標記的B1自dsDNA上解離下來。取出含B1的溶液轉(zhuǎn)移到固定了C1的酶標板凹槽，通過雙鏈互補配對原則，B1被C1捕獲。FITC能捕獲帶HRP標簽的FITC抗體，HRP能催化TMB底物顯藍色，加入2 mol/L酸后藍色產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。

圖1 競爭取代酶聯(lián)適配體分析的示意圖Fig.1 Detection principle diagram of enzyme-linked aptamer assay with competition replacement mechanism

2.2 檢測結果及標準曲線

圖2 (A)檢測不同濃度ENRX的照片；(B)450 nm的紫外吸收與ENRX濃度的關系曲線(插圖(C)為(B)曲線中的線性部分)Fig.2 (A)Photographs of detecting different concentrations of ENRX;(B)Relationship between the UV absorption of 450 nm and the concentration of ENRX;(Inset:(C)is the linear part of (B) curve)The experimental conditions：[A1]=20 pmol/well,[B1]=50 pmol/well,[C1]=30 pmol/well,[ExoI]=5 U/well,[anti-FITC-HRP]=12.5 ng/well,[TMB]=1.2 mmol/L.The error bar represented the standard deviation of the three independent experiments.

在最優(yōu)的實驗條件下，競爭取代酶聯(lián)適配體分析試劑盒測定不同濃度ENRX的實驗結果見圖2。由圖2(A)照片可以看出，隨著ENRX濃度的增加，溶液的顏色逐漸加深。肉眼觀察的檢測限為200 nmol/L(相當于72.0 μg/kg)。相應的，從圖2(B)可以看出，隨著ENRX濃度的增加，A450吸光度不斷增大，開始時增加很快，后來趨于緩慢。在100～700 nmol/L(相當于35.9～251.6 μg/L)范圍內(nèi)，在450 nm處的凈吸收值(A450-A450(blank))與ENRX的濃度呈良好的線性關系(圖2(C))。以信噪比大于3為可測信號標準，經(jīng)實驗得到ENRX的檢測限為75.0 nmol/L(相當于26.9 μg/L)。歐盟對ENRX在肌肉組織中的最大殘留限量(MRL)作出明確規(guī)定，要求不高于30 μg/kg。我國對動物源性食品中ENRX的要求是肌肉組織中ENRX的MRL不高于100 μg/kg。所以，研制的試劑盒可以滿足我國規(guī)定的檢測需求，也能滿足歐盟高標準檢測需求。

2.3 試劑盒檢測性能評價

2.3.1添加回收實驗及精密度采用上述研制的酶聯(lián)適配體分析試劑盒，對豬肉、羊肉、魚肉進行檢測，分別添加25、50、100 ng/g 3個濃度水平的ENRX，取同一批次包被板，對同種樣品進行檢測，計算批內(nèi)變異系數(shù)，再取不同批次的包被板，對同種樣品進行檢測，計算批間變異系數(shù)，分別得到相同及不同批次樣品的精密度，結果見表2。由表2可知所建立方法對實際樣品檢測的準確度和精密度良好，符合檢測要求。

表2 鮮肉樣品添加回收實驗(n=5)

2.3.2特異性選擇諾氟沙星、加替沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、萊克多巴胺作為參照物，在相同測試條件下，當ENRX的濃度為1 μmol/L，而其它物質(zhì)濃度為10 μmol/L時，比較450 nm波長處的凈吸收值(凈吸收值=A450-A450(blank))，并計算交叉反應率P/N(P為對照物的凈吸收值，N為ENRX的凈吸收值)。由實驗結果可知，交叉反應率P/N均小于4%，與環(huán)丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星的交叉反應率分別為3.46%、2.89%和2.33%，與其他結構類似物和功能類似物的交叉反應率均小于2%，說明除了加入恩諾沙星的體系外，其它體系檢測結果的凈吸收值都沒有明顯的提高(即使其它6個參照物濃度提高了10倍)，表明該方法對ENRX的檢測具有較高的特異性。

2.3.3穩(wěn)定性試劑盒經(jīng)-20 ℃到室溫的反復凍融后的測試結果顯示，反復凍融60次后An/A0為0.86，0.86>0.8，說明檢測體系的凈吸收值沒有明顯變化，即試劑盒穩(wěn)定性良好。

2.3.4保存期限試劑盒保存前測得的凈吸收值為A0，試劑盒保存一段時間取出后測得的凈吸收值為Am，計算Am/A0，當Am/A0≤0.8時，認定試劑盒失效。由表3有效期試驗結果可知，試劑盒在37 ℃，保存一周失效。試劑盒在4 ℃可以保存半年以上，試劑盒在-20 ℃可保存3年。

表3 試劑盒有效期實驗結果

2.3.5成本分析試劑盒中的成分除了DNA和Anti-FITC-HRP都是常規(guī)試劑。就目前合成技術，DNA已能夠批量合成，合成2 OD用量時上去一個堿基10元左右，做96口反應需DNA 0.4～0.6 OD；100 μL Anti-FITC-HRP 395美元，做96口反應需2 μL足夠。再加上其它試劑，一個能做96口反應的試劑盒大約四百元，比市售的常規(guī)酶聯(lián)免疫分析試劑盒便宜。隨著DNA合成技術的進步，如果能在DNA上直接標記HRP，將不必使用Anti-FITC-HRP，還將大大降低成本。

2.4 食品樣品檢測

應用本試劑盒檢測興城南關農(nóng)貿(mào)市場采集的30個鮮豬肉樣本，結果18個樣本檢出有ENRX殘留，其中5個樣本的殘留量在42.3～100.2 μg/kg之間，低于我國規(guī)定的最大殘留限量，13個樣本的殘留限量在101.3～182.0 μg/kg之間，高于我國規(guī)定的最高殘留限量。我們研制的試劑盒的檢測結果和商用的ELISA試劑盒檢測結果基本一致，ELISA試劑盒也檢出18個樣本有ENRX殘留，殘留量在40.1～158.4 μg/kg之間。說明研制的試劑盒可信度高，能用于檢測實際樣本中的ENRX殘留。

3 結論

本文研制了ENRX的酶聯(lián)適配體分析檢測試劑盒，該試劑盒的檢測限為26.9 μg/L，線性檢測范圍為35.9～251.6 μg/L；應用于各樣品的添加回收率均落在93%～110%之間，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%；與結構類似物和功能類似物的交叉反應率都小于4%；在-20 ℃環(huán)境中，能保存3年以上，在4 ℃環(huán)境中，能保存6個月以上；穩(wěn)定性好，抵抗反復凍融至少60次。本文研制的試劑盒的靈敏度高、特異性強，具有準確、快速、簡便的優(yōu)點，能夠滿足動物源性食品中ENRX的快速篩查的需求。