一種基于重組聚合酶擴增和紙基電化學發(fā)光的核酸檢測方法

夏 舒， 陳 鈺， 李 昕， 張海燕， 劉仲明， 王 捷*

(1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006;2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學實驗科， 廣東廣州 510010)

傳統(tǒng)的核酸檢測技術主要有聚合酶鏈式反應(PCR)、原位熒光雜交技術(FISH)[1]、DNA測序技術[2]等。PCR是目前運用最廣泛的核酸分子檢測技術，但依賴精密的控溫設備及專人操作，使其只能在條件完備且專業(yè)化程度高的實驗室應用。核酸等溫擴增技術是20世紀90年代提出的新型核酸擴增技術，相比于PCR，其可以在恒定的溫度下對核酸進行擴增，大大降低了對儀器的要求[3]。2006年，英國TwistDx Inc公司開發(fā)了一種重組酶聚合酶擴增(RPA)技術，RPA反應可在25～42 ℃恒溫條件下快速完成核酸擴增[4]，反應條件寬松。目前RPA結合凝膠電泳[5]、側流層析[6]和熒光探針法[7]等不同的結果判讀方法，已開發(fā)出多種較為成熟的檢測試劑盒[4]，但是判讀方法難以做到快速且高靈敏地檢測。電化學發(fā)光法(ECL)[8]檢測具有靈敏度高、檢測線性范圍寬、抗干擾能力強和檢測時間短等特點[9]。邢達和周小明等將PCR與ECL結合進行轉基因[10]和基因突變[11]檢測，方法具有較高的檢測靈敏度。但是傳統(tǒng)的電化學檢測池由于樣品殘留問題，容易造成交叉污染[12]。采用一次性紙芯片[13]電極可避免該問題的產生，而且紙芯片電極具有檢測用量少、成本低、操作方便等特點[14]。吳魯?shù)15]等將滾環(huán)擴增(RCA)與紙基ECL檢測結合，對IgG的檢測限達到0.15 fmol/L，但是RCA時間相對較長(>60 min),而且只適用于環(huán)形DNA或環(huán)狀核酸，因此在實際運用中受到極大的限制。

本研究以含乙型肝炎病毒(HBV)基因片段的質粒為模板，設計特異性引物，上游引物標記三聯(lián)吡啶釕，生物素標記下游引物，重組聚合酶擴增反應形成雙標記擴增子，磁分離純化后進行紙基ECL檢測。將RPA技術與紙基ECL結合，構建一種靈敏特異、操作簡便、快速低成本的分子檢測技術，可為核酸的快速檢測提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

聚合酶鏈式反應(PCR)儀(MJ Mini S/N:MMO10907,美國BIO-RAD公司)；紙芯片電化學發(fā)光測試儀[16](XQT-152,廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院與西安新啟特儀器儀表有限公司聯(lián)合研制)；Nanodrop 2000分光光度計與Multiskan GO全波長酶標儀(芬蘭Thermo Fisher Scientific公司)；恒溫金屬浴(美國CORNING公司)；SIGMA1K5離心機(美國Sigma-Aldrich公司)；8孔磁分離架與Amicon Ultra-0.5(0.5 mL 3 KD)超濾管(德國Millipore公司)；Zensor三電極紙芯片(No.TE100-OA，禪譜科技股份有限公司)；Whatman 1號色譜紙(英國Whatman公司)。

含乙型肝炎病毒(HBV)基因片段質粒(濃度：120 ng/μL)和對應的特異性引物由中國人民解放軍302醫(yī)院提供和設計；氨基修飾引物和生物素標記引物(NH2-AGCATCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATG,Biotin-GACCTGCCTCGTCGTCTAACAACAC,分子量分別為9145.1和7951.9,蘇州泓訊生物科技公司)；TwistAmpTM-Basic RPA試劑盒(英國TwistDx-Inc公司)。鏈霉親和素磁微球(濃度：0.72 mg/mL,瑞士Roche公司)，三丙胺(TPA,美國Sigma-Aldrich公司)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF,99.5%,分析純,美國Sigma-Aldrich公司)，酯化釕(Bis(2,2′-Bipyridine)-4′-methyl-4-carboxybipyridine-ruthenium N-succinimidyl ester-bis (hexafluorophosphate),λAbsorption=455 nm,ε=13 700 L/(mol·cm),Ru-NHS ester,美國Sigma-Aldrich公司)，H3BO3和NaOH(廣州化學試劑廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1三聯(lián)吡啶釕標記引物標記參考文獻方法[17]并有所改進。取1 mg酯化釕溶于98.5 μL DMF中，振蕩混勻，配成10 mmol/L溶液于4 ℃保存待用。將2.9 nmol氨基修飾引物8 000×g、4 ℃離心5 min，加入58 μL 0.1 mol/L H3BO3(pH=8.5)，振蕩混勻后5 000×g、4 ℃離心3 min，配成50 μmol/L氨基修飾引物溶液。取5 μL濃度10 mmol/L酯化釕溶液和50 μL濃度50 μmol/L氨基修飾引物溶液混合均勻(摩爾比20∶1)，室溫避光混勻，30 r/min反應12 h。反應完成后加入去離子水(ddH2O)至500 μL,超濾管14 000×g離心分離30 min洗脫游離酯化釕,1 000×g反向離心2 min回收三聯(lián)吡啶釕標引物，重復以上操作3次。分別對氨基修飾引物、酯化釕和三聯(lián)吡啶釕標記引物進行波段(200～1 000 nm)掃描，確定最佳吸收波長，利用分光光度法分別對三聯(lián)吡啶釕標記引物和氨基修飾引物溶液進行測定，并計算標記率。

1.2.2重組聚合酶擴增反應參數(shù)優(yōu)化RPA反應體系(50 μL)包括：2.4 μL三聯(lián)吡啶釕標引物、2.4 μL生物素標記引物、29.5 μL緩沖溶液、13.2 μL HBV質粒模板、干粉試劑(TwistAmp? Basic試劑)以及280 mmol/L Mg(Ac)2。設計擴增時間、溫度、引物濃度和Mg(Ac)2添加量四因素五水平的正交試驗，具體見表1。分別進行ECL檢測，分析確定最佳RPA擴增條件。

表1 正交試驗因素和水平設計

1.2.3磁分離及紙基電化學發(fā)光核酸檢測取2 μL RPA擴增產物、8 μL 0.72 mg/mL鏈霉親和素磁珠和20 μL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.4)混合均勻，置于37 ℃下孵育30 min，12 000×g離心2 min，磁力架固定磁珠并吸取上清液，加入PBS洗滌3次。將清洗后的磁珠均勻分散于5 μL濃度為40 mmol/L TPA中，并滴加至紙基電極上，在0.2～1.5 V范圍內，以0.1 V/s的掃描速率進行循環(huán)伏安掃描，在PMT為1 000 V下檢測電化學發(fā)光響應。

2 結果與討論

2.1 三聯(lián)吡啶釕標記引物及表征

圖1 氨基修飾引物溶液、酯化釕溶液、三聯(lián)吡啶釕標記引物溶液、ddH2O紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectra of amino modified primer solution,Ru-NHS ester solution,tripyridine ruthenium labeled primer solution and ddH2O

酯化釕和三聯(lián)吡啶釕標引物溶液在455 nm波長處均出現(xiàn)明顯的信號峰，而引物與ddH2O并未出現(xiàn)明顯的信號峰(圖1)。根據(jù)反應方程式(圖2)及相關文獻[17]，酯化釕與氨基修飾引物反應摩爾比為1∶1，因此可通過測定455 nm波長下三聯(lián)吡啶釕標引物的摩爾量得到實際參加反應的氨基修飾引物的摩爾量。實驗測得氨基修飾引物稀釋10倍后，在波長為260 nm時的吸光度A260為2.612，三聯(lián)吡啶釕標引物在波長455 nm時的吸光度A455為0.146，因此通過以下公式計算得到標記率為74.62%。

/(ε·d·F·A260·D·VNH2-Primer)×100%

圖2 酯化釕與氨基修飾引物化學反應方程式Fig.2 Chemical equation of Ru-NHS ester reacts with amino modified primer

2.2 重組聚合酶擴增反應相關條件的優(yōu)化

試驗結果見表2。經(jīng)正交試驗設計及電化學發(fā)光檢測分析得出，相關條件最佳組合為A3B1C4D4，即RPA最佳擴增時間為20 min，擴增溫度為30 ℃，引物濃度為0.8 μmol/L(添加量為2.4 μL)，Mg(Ac)2的濃度為280 mmol/L(添加量2.5 μL)。通過極差分析可得，相關因素的影響程度為：擴增時間>擴增溫度>引物濃度>Mg(Ac)2添加量。重組聚合酶擴增技術可以在短時間內對HBV基因質粒核酸進行擴增，且擴增可在恒定溫度下進行，不受溫度條件的限制，適合于條件有限的現(xiàn)場快速檢測方面的運用。

表2 RPA相關影響因素的正交試驗設計及紙基ECL檢測分析

(續(xù)表2)

No.ABCDAmplification time(min)Amplification temperature(℃)Tripyridine ruthenium labeled primer concentration(μmol/L)Magnesium acetate volume(μL)Test result (Peak area,y)62(10 min)12341187223441028234534979245130521025123225113(20 min)135101911232416971133352399714341332091535244143164(25 min)14259401742535798184314410319442541582045313483215(30 min)15462982252153000235321209224543225552555432132y?i14205.2579731953607.2y?i23598.84389.83317.83559y?i35702.235674895.43880.6y?i44696.442315344.25365.4y?i53215.43433.24665.65005.8Max5702.2(A3)5797(B1)5344.2(C4)5365.4(D4)Range2486.82363.82149.21806.4

*yij=(∑yij)/5)，i=1,2,3,4;j=1,2,3,4,5.

圖3 不同濃度HBV基因質粒模板的ECL響應圖(內插圖為校正曲線)Fig.3 ECL response of different concentrations of HBV gene plasmid template(inset is calibration curve)from a to h:0,0.0012,0.012,0.12,1.2,12,120,1200 ng/mL respectively.

2.3 紙基電化學發(fā)光響應特性

2.3.1線性范圍及檢出限電化學發(fā)光響應特性見圖3，隨著HBV基因質粒樣品濃度的增加，電化學發(fā)光響應強度也隨之增大，且樣品電化學發(fā)光響應強度在0.12～1 200 ng/mL濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關系，檢出限(S/N>3)為1.2 pg/mL。所構建的方法對HBV基因檢測具有較高的靈敏度和較寬的線性范圍。

2.3.2重復性通過相對標準偏差(RSDs)考察方法的重復性，選擇0.12 ng/mL和120 ng/mL兩個濃度的HBV基因質粒樣品，每個濃度樣品進行5次RPA-ECL重復性檢測，得到電化學響應特性見圖4。計算得出RSD分別為5.18%和6.40%，說明本方法的重復性良好。

圖4 120 ng/mL(a)和0.12 ng/mL(b)HBV基因質粒模板ECL重復檢測響應圖Fig.4 ECL responses of repeated test on HBV gene plasmid template at 120 ng/mL (a) and 0.12 ng/mL (b)

3 結論

本研究將重組聚合酶擴增技術與紙基電化學發(fā)光檢測相結合，利用了電化學發(fā)光靈敏度高、線性范圍寬、抗干擾能力強和RPA技術特異性高、操作簡便的特點，通過外加磁場快速高效地分離出RPA擴增產物，利用一次性紙基電極，簡化了操作步驟，避免了交叉污染，降低了檢測成本。最終構建出一種高特異性、高靈敏度、操作簡便、快速低成本的核酸檢測方法，在條件有限的現(xiàn)場快速檢測領域有非常好的應用前景。