蕉嶺自然生長紫云英中硒的賦存形態(tài)研究

呂鑒泉*, 羅諾琳， 謝水勇, 張恒銘

(嘉應(yīng)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東梅州 514015)

廣東省梅州市蕉嶺縣是國際自然醫(yī)學(xué)會(huì)認(rèn)定的世界第七個(gè)“世界長壽鄉(xiāng)”(中國第四個(gè)“世界長壽鄉(xiāng)”)，長壽現(xiàn)象激起了人們對蕉嶺的人文、自然與生態(tài)環(huán)境、飲食習(xí)慣等方面的研究興趣，特別是蕉嶺的富硒環(huán)境對長壽的貢獻(xiàn)。

硒是一種生命體必須的化學(xué)元素，既具營養(yǎng)與藥理功能、又有毒理效應(yīng)[1 - 2]。其功能與效應(yīng)，一方面取決于硒存在的化學(xué)形態(tài)，不同形態(tài)的硒存在差別明顯的毒理、藥理效應(yīng)[3]；另一方面，還與總硒以及不同硒形態(tài)的濃度水平直接相關(guān)，硒的匱乏往往誘發(fā)區(qū)域性疾病，而過量的硒可引起神經(jīng)系統(tǒng)異常乃至死亡[4]。因此，在研究富硒環(huán)境對長壽的貢獻(xiàn)時(shí)，硒的存在形態(tài)及其獲取方法、毒(藥)效應(yīng)及其生物可利用度等方面信息至關(guān)重要。目前，就農(nóng)產(chǎn)品中各種硒形態(tài)的提取、分離與檢測技術(shù)而言，無機(jī)硒的技術(shù)較為成熟，而有機(jī)硒的技術(shù)則因其形態(tài)的多樣性與復(fù)雜性尚待在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善[5]。

本文以蕉嶺境內(nèi)生長周期短[6]、富硒能力強(qiáng)[7]的紫云英為研究對象，采用廣泛使用的溶劑提取、微波消解、氫化物-原子熒光光譜法探討硒的賦予形態(tài)及其變化，以期為總結(jié)蕉嶺生態(tài)地理環(huán)境中硒的轉(zhuǎn)化及其對長壽的貢獻(xiàn)提供基礎(chǔ)信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與儀器

硒元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL，中國計(jì)量科學(xué)研究院)，透析袋(7 000 Da，上海源葉生物科技有限公司)。所用其它藥品均為國產(chǎn)分析純及以上規(guī)格的試劑，實(shí)驗(yàn)用水均為本實(shí)驗(yàn)室自制的超純水。

AFS933原子熒光光度計(jì)(北京吉天儀器有限公司)；XH-200A電腦微波固液相合成/萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)；XH-2008D型電腦智能溫控低溫超聲波合成萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)；TG20-WS高速離心機(jī)(鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司)；XS-02多功能粉碎機(jī)(上海兆申科技有限公司)。

1.2 樣品采集及處理

現(xiàn)蕾期、盛花期和成熟期自然生長的紫云英樣品，分別于3月上旬、4月中旬和5月底采集自廣東省梅州市蕉嶺縣三圳鎮(zhèn)約2平方公里區(qū)域內(nèi)，每期10個(gè)點(diǎn)的全草作為樣品，并分別標(biāo)記為A、B、C。各期的新鮮紫云英棄去雜草、枯葉、泥土和污垢，水洗凈，烘干，粉碎，過100目篩，粉末分別裝入試劑瓶中保存，備用。

1.3 測定方法

1.3.1硒的定量根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中硒的測定》(GB 5009.93-2010)，采用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HG-AFS)，按照表1條件測定硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，取3次測定的平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定樣品時(shí)，控制與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的條件，均由熒光強(qiáng)度換算成硒含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.07～10.00 μg/L的硒與信號(hào)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，響應(yīng)方程：y=33.13x+1.03，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9998。該方法的檢出限為0.0657 μg/L；重復(fù)11次測量10 μg/L的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，測量結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.05%。

表1 測量條件

1.3.2總硒含量的測定借鑒文獻(xiàn)方法[8]微波消解樣品。具體操作如下：準(zhǔn)確稱取0.5 g紫云英粉末于三頸燒瓶中，分別加入5 mL濃HNO3和1 mL 30% H2O2，在120 ℃、800 W功率下微波消解30 min，電爐上加熱至溶液澄清透明，冷卻至室溫，加入HCl(1+4)，轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，定容。取適當(dāng)體積的消解液用HG-AFS法測定總硒的含量。

1.3.3無機(jī)硒含量的測定按照文獻(xiàn)方法[9]，準(zhǔn)確稱取紫云英干粉0.5 g，放入研砵中，滴加少許超純水充分濕潤紫云英粉末，在研砵中用力碾磨紫云英粉末以使細(xì)胞充分破裂，碾磨后的粉末轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入10 mL超純水，沸水浴中提取30 min，冷卻至室溫，在550 W條件下超聲10 min，溶液在4 000 r/min條件下離心10 min，上清液用HG-AFS法測定無機(jī)硒的含量。

1.3.4核酸硒含量的測定借鑒文獻(xiàn)方法[10]，采用濃鹽法提取-微波消解-HG-AFS法測定紫云英中核酸硒的含量。具體操作如下：準(zhǔn)確稱取紫云英干粉0.5 g，加入15 mL 12% NaCl溶液，于沸水浴中反應(yīng)40 min后抽濾，用相同步驟對濾渣重提二次，合并濾液，用10 mL氯仿-正丁醇(4∶1，V/V)除去蛋白質(zhì)后，溶液用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.5，4 ℃靜置12 h，3 000 r/min離心30 min，得核酸沉淀，用95%乙醇多次沖洗沉淀，微波消解沉淀，HG-AFS法測定紫云英中核酸硒。

1.3.5多糖硒含量的測定參考文獻(xiàn)方法[11]，在提取核酸的基礎(chǔ)上，采用草酸法提取-微波消解-HG-AFS法測定紫云英中多糖硒的含量。具體操作如下：向提核酸后的濾渣中加入25 mL 3%的草酸溶液，沸水浴中提取30 min，抽濾，重提二次,合并濾液,用15 mL的氯仿-正丁醇(4∶1，V/V)除去蛋白質(zhì)后,水相加入300 mL 95%乙醇，4 ℃下靜置12 h,3 000 r/min離心30 min,得多糖沉淀,用85%乙醇多次沖洗沉淀，按上述微波消解沉淀、HG-AFS法測定多糖硒。

1.3.6蛋白硒含量的測定參考文獻(xiàn)方法[12]，具體操作如下：準(zhǔn)確稱取0.5 g紫云英粉末至燒杯中，加入15 mL 0.1 mol/L KOH溶液，于50～60 ℃水浴中攪拌提取4 h，抽濾，用0.1 mol/L KOH溶液重復(fù)2次處理濾渣。合并濾液，加(NH4)2SO4至50%飽和度，4 ℃冰箱中靜置過夜，4 000 r/min下離心15 min，收集沉淀。沉淀用5 mL Tris-HCl溶液(pH=8)溶解，轉(zhuǎn)移至預(yù)處理好的透析袋中，純水中透析直至透析液不與10% BaCl2產(chǎn)生白色沉淀。樣品按HG-AFS法測定蛋白硒的含量。

參考文獻(xiàn)方法[13]，具體操作如下：測定水溶性、鹽溶性、醇溶性和堿溶性硒蛋白含量時(shí)，依次用相同體積的水、0.5 mol/L NaCl、75%乙醇溶液和0.1 mol/L KOH為浸提液(代替0.1 mol/L KOH溶液)，除水溶性硒蛋白需要水浴提取外其它硒蛋白均在不加熱條件下提取，分別用少量浸提液溶解沉淀的蛋白質(zhì)，其它操作與蛋白硒所述的相同，用微波消解-HG-AFS法測定對應(yīng)的蛋白硒含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 總硒、無機(jī)硒與有機(jī)硒

按照實(shí)驗(yàn)方法測定紫云英中總硒和無機(jī)硒，有機(jī)硒含量為總硒與無機(jī)硒的差值，結(jié)果列于表2。從表中數(shù)據(jù)可以看出：(1)隨著紫云英的生長成熟，其中的總硒含量也隨之增加，從現(xiàn)蕾期到盛花期總硒含量增長了26.7%，從盛花期到成熟期總硒含量增長了50.8%；(2)現(xiàn)蕾期、盛花期和成熟期的紫云英，有機(jī)硒含量分別為89.0%、91.7%和93.7%，無機(jī)硒含量分別為11.0%、8.30%和6.36%，數(shù)據(jù)說明，紫云英中硒的主體是有機(jī)硒，并且隨著紫云英的生長成熟無機(jī)硒的比重降低、有機(jī)硒的占比上升。此結(jié)果與周乾坤等人[14 - 16]人工施加亞硒酸鈉于土壤或者葉面所培植的紫云英各項(xiàng)硒比例基本一致。

表2 紫云英中的總硒、有機(jī)硒與無機(jī)硒

*average ± standard deviation(n=5).

植物中的硒有無機(jī)形態(tài)的硒(簡稱無機(jī)硒)和有機(jī)形態(tài)的硒化物(簡稱有機(jī)硒)兩種形態(tài)。無機(jī)硒主要以單質(zhì)硒、金屬硒化合物、硒酸鹽或者亞硒酸鹽等形式存在于植物之中，其典型特征是價(jià)態(tài)多樣性，易溶解于水[9,17]。有機(jī)硒的特征是直接與碳成鍵的、并以-2價(jià)存在于蛋白質(zhì)、脂肪、多糖和核酸等有機(jī)分子中[18]。

2.2 有機(jī)硒的賦予形態(tài)

按照實(shí)驗(yàn)方法測定核酸硒、多糖硒和蛋白硒的含量，結(jié)果匯總于表3。表3數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)蕾期紫云英核酸硒、多糖硒和蛋白硒分別為5.70%、15.0%、71.0%，還有約8.30%的其它形態(tài)有機(jī)硒；盛花期紫云英核酸硒、多糖硒和蛋白硒分別為3.10%、15.5%、74.6%，其它形態(tài)有機(jī)硒約有6.83%；成熟期紫云英核酸硒、多糖硒和蛋白硒分別為2.24%、16.3%、76.2%，其它形態(tài)有機(jī)硒約有5.27%。這些數(shù)據(jù)說明：(1)隨著紫云英的生長成熟，蛋白硒和多糖硒有一定程度的增加，而核酸硒和其它形態(tài)有機(jī)硒稍有降低的趨勢；(2)按照含硒量由高到低排列，蛋白質(zhì)硒>多糖硒>核酸硒；(3)86%～92%的有機(jī)硒主要存在于蛋白質(zhì)和多糖之中，也就是說蛋白質(zhì)和多糖是紫云英中硒的主要賦存形態(tài)。

表3 紫云英中的有機(jī)硒形態(tài)

*average ± standard deviation(n=5).

紫云英中有機(jī)硒的形態(tài)分布，與刺參[8]、蛹蟲草[9]、藍(lán)莓[13]、靈芝[19]、枸杞[20]等植物中有機(jī)硒的分布非常相似。其原因可能是，因硒與硫?qū)儆谕恢髯迩倚再|(zhì)相似，無機(jī)硒經(jīng)吸收后，硒往往是沿著硫代謝的途徑，產(chǎn)生的一些R-Se-R形式的氨基酸、含硒多肽、硒多糖和含硒RNA等有機(jī)分子[21]。

2.3 蛋白硒的賦予形態(tài)

圖1 紫云英中水溶性、鹽溶性、醇溶性和堿溶性硒蛋白Fig.1 Water-soluble,sodium chloride-soluble,ethanol-soluble and alkali-soluble selenium protein in Astragalus sinicus

為進(jìn)一步探究紫云英中蛋白硒的存在方式，分別用水、NaCl、乙醇和KOH溶液為浸提液提取紫云英中的水溶性、鹽溶性、醇溶性和堿溶性硒蛋白等四種蛋白[19]，結(jié)果見表4。表4數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)蕾期紫云英中水溶性、鹽溶性、醇溶性和堿溶性硒蛋白分別為47.91%、11.23%、9.43%和24.81%，還有約6.62%的其它形態(tài)硒蛋白；盛花期紫云英中水溶性、鹽溶性、醇溶性和堿溶性硒蛋白分別為41.13%、9.91%、11.75%和29.07%，另有約8.14%的其它形態(tài)硒蛋白；成熟期四種硒蛋白分別為39.45%、7.24%、12.83%和31.23%，有9.25%的其它形態(tài)硒蛋白。各個(gè)生長時(shí)期的各種硒蛋白的變化規(guī)律于圖1所示。這些數(shù)據(jù)顯示：(1)隨著紫云英的生長成熟，各種溶解性蛋白的含硒量均有增加，但醇溶性、堿溶性和其它形態(tài)硒蛋白的硒比重有一定程度的增加，而水溶性、鹽溶性硒蛋白的硒占比稍有降低；(2)按紫云英中蛋白含硒量從多到少的排序，其為水溶性硒蛋白>堿溶性硒蛋白>醇溶性硒蛋白>鹽溶性硒蛋白；(3)硒蛋白主要以水溶性和堿溶性硒蛋白形式存在，約占得硒蛋白含量的70%，說明紫云英中的蛋白是酸性或極性較強(qiáng)的蛋白[19]。

表4 紫云英中的蛋白硒形態(tài)

*average ± standard deviation(n=5).

一般而言，蛋白質(zhì)依其溶解性可以分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麥谷蛋白和殘?jiān)鞍椎任孱怺22]。清蛋白為水溶蛋白，分子量較低，溶于水；球蛋白俗稱鹽溶蛋白，易溶于稀鹽水；醇溶蛋白是通過氫鍵和疏水鍵相互作用形成的單鏈蛋白，可用50%～90%乙醇提??；堿溶性蛋白，又稱麥谷蛋白，是指通過分子間二硫鍵連接多個(gè)亞基而成的大分子物質(zhì)，易溶于稀酸或稀堿(其溶解性隨肽鏈上二硫鍵數(shù)目的增加而減小)，但不溶于水、鹽及醇溶液。殘?jiān)鞍资侵妇哂欣w維狀結(jié)構(gòu)，不溶于水，但可以酶解。由于生命體的胃液等為弱酸性，以水溶性和堿溶性硒蛋白為主體的硒蛋白，可以被生命體吸收。

3 結(jié)論

本文采用溶劑提取、微波消解、氫化物發(fā)生-原子熒光光度法等技術(shù)，研究了各個(gè)生長時(shí)期紫云英中硒的賦存形態(tài)。結(jié)果表明，隨著紫云英的生長成熟，總硒含量和有機(jī)硒含量逐漸增加，無機(jī)硒含量逐漸降低。成熟期的紫云英中，總硒量為1382 μg/kg，有機(jī)硒達(dá)到總硒的93.7%；有機(jī)硒主要以蛋白硒和多糖硒形態(tài)存在，分別占總硒量的76.2%和16.3%；而蛋白硒主要表現(xiàn)為易于被生命體吸收的水溶性硒蛋白和堿溶性硒蛋白形態(tài)，分別占蛋白硒量的39.5%和31.2%。