3,4-二羥基苯乙酮通過AMPK途徑降低肝細(xì)胞及肝臟組織的甘油三酯含量*

張代娟, 劉江月, 王建英

(濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 山東 濰坊 261053)

3,4-二羥基苯乙酮(3,4-dihydroxyacetophenone, 3,4-DHAP)是從具有活血化瘀作用的中藥——禿毛冬青葉中提取的單體成分，在臨床上被試用于治療冠心病、妊娠高血壓綜合征和慢性阻塞性肺病等疾病，有較好的療效；在實(shí)驗(yàn)水平發(fā)現(xiàn)3,4-DHAP具有抑制血小板聚集和抑制血栓形成等作用；另外，我們發(fā)現(xiàn)其還具有抗炎作用[1-2]。眾所周知，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是許多心腦血管疾病的基本病理過程，其發(fā)病機(jī)制涉及炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝異常等多方面。我們發(fā)現(xiàn)3,4-DHAP在AS斑塊炎癥反應(yīng)中有較好的抗炎效果，同時(shí)也觀察到其具有降脂作用：如在ApoE-/-小鼠AS模型中，3,4-DHAP可降低小鼠血漿總膽固醇(total cholesterol, TC)和甘油三酯(triglyceride, TG)[3]；在新西蘭大白兔AS模型中，3,4-DHAP可降低血漿TC、TG及低密度脂蛋白膽固醇，亦可降低兔肝臟的TC和TG水平[2]。3,4-DHAP通過什么途徑改善肝臟脂質(zhì)代謝呢？我們擬從脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)途徑之一——AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)途徑入手，揭示3,4-DHAP的降脂作用機(jī)制，為其臨床推廣提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

雄性新西蘭大白兔，由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，9周齡，清潔級(jí)，體重(2.5±0.2) kg。

2 主要試劑

3,4-DHAP購(gòu)自TCI；辛伐他汀粉劑購(gòu)自Sigma；抗AMPK抗體、抗磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK, p-AMPK)(Thr172)抗體、抗磷酸化固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(phosphorylated sterol regulatory element binding protein 1c, p-SREBP-1c)(Ser372)抗體、抗磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(phosphorylated acetyl-CoA carboxylase, p-ACC)(Ser79)抗體、qPCR試劑盒和TG試劑盒購(gòu)自Sigma。

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 L02細(xì)胞由濰坊醫(yī)學(xué)院段譽(yù)副教授贈(zèng)送，常規(guī)傳代培養(yǎng)，置于37 ℃、 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分組：正常對(duì)照(control)組、模型(model)組、3,4-DHAP組和辛伐他汀組。模型復(fù)制方法：將細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到80%密度時(shí)，換成無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)大約12 h，再用0.1 mmol/L油酸(oleic acid, OA)孵育24 h。各組藥物處理如下：正常對(duì)照組(培養(yǎng)基)，模型組(OA+培養(yǎng)基)，3,4-DHAP組(3,4-DHAP+OA+培養(yǎng)基)，辛伐他汀組(辛伐他汀+OA+培養(yǎng)基)。3,4-DHAP終濃度為10-7mol/L，辛伐他汀終濃度為10-7mol/L[3]。藥物處理8 h后，收集細(xì)胞。

3.2細(xì)胞油紅O染色 將細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，按照方法3.1分組處理之后，倒掉培養(yǎng)液，用 PBS 洗滌細(xì)胞2次。用50%異丙醇固定細(xì)胞2 min。用蒸餾水將0.5%油紅O儲(chǔ)存液按2∶3比例稀釋，過濾，染色10 min。倒掉染色液后用70%乙醇洗1 min，放顯微鏡下觀察，細(xì)胞中的紅色顆粒即為脂質(zhì)。用異丙醇復(fù)溶油紅O，在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(A)值。

3.3細(xì)胞內(nèi)TG含量的檢測(cè) 用PBS洗滌處理后的各組細(xì)胞2次，加入RIPA裂解液，冰浴10 min。4 ℃、 12 000×g離心10 min，取上清。上清液中的TG含量檢測(cè)根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行。裂解液的蛋白濃度用Bradford法測(cè)得。TG含量表示為mg/g蛋白。

3.4RT-qPCR檢測(cè)AMPK的mRNA表達(dá) 將細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，按照方法3.1分組處理后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入TRIzol液提取細(xì)胞總RNA，具體步驟按RT-qPCR試劑盒操作說明進(jìn)行，具體反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min; 95 ℃ 15 s、 60 ℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以2-ΔΔCt計(jì)算，引物序列見表1[4]。

表1 RT-qPCR引物序列

3.5Western blot法檢測(cè)AMPK、p-AMPK、p-SREBP-1c和p-ACC蛋白水平 將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，按方法3.1處理后，在冰上用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。用Bradford法測(cè)得各組蛋白濃度。SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜。分別加入I抗，室溫下孵育2 h，洗滌后加入II抗，室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯示條帶，利用凝膠成像處理系統(tǒng)分析條帶。

3.6兔動(dòng)脈粥樣硬化模型造模 將適應(yīng)環(huán)境1周的32只雄兔隨機(jī)分為正常對(duì)照(control)組、模型(model)組、3,4-DHAP組和辛伐他汀組。正常組兔標(biāo)準(zhǔn)飲食，高脂(1% 膽固醇、 5%豬油和7.5%蛋黃粉)飼養(yǎng)模型組、3,4-DHAP組、辛伐他汀組兔，每只兔每天喂食飼料120 g，自由飲水。3,4-DHAP組和辛伐他汀組兔給藥劑量為10 mg/kg，腹腔注射。藥物處理12周后，收集肝臟標(biāo)本。

3.7肝臟組織油紅O染色 取各組肝臟，包埋做冰凍切片，60%異丙醇浸潤(rùn)2 min，油紅O染色10 min，60%異丙醇調(diào)色，蘇木素復(fù)染1 min，自來水沖洗返藍(lán)，甘油明膠封片。

3.8肝臟組織TG檢測(cè) 取肝組織約50 mg，加入氯仿和甲醇(2∶1)提取液2.5 mL，制作勻漿液，室溫下抽提12 h，取上清，用TG試劑盒測(cè)TG含量。勻漿液的蛋白濃度用Bradford法測(cè)得。TG含量表示為mM/g蛋白。

3.9Western blot法檢測(cè)肝臟組織中AMPK、p-AMPK、p-SREBP-1c和p-ACC蛋白水平 將-80 ℃凍存的肝臟組織取出約30 mg置研缽中迅速磨成粉狀，加入裂解液提取蛋白。余下步驟同方法3.5。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析。組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞脂化及TG含量

油紅O染色結(jié)果可以看出，模型組細(xì)胞內(nèi)的脂滴明顯增多；3,4-DHAP及辛伐他汀處理后的細(xì)胞內(nèi)脂滴較模型組明顯減少，見圖1A。模型組及藥物處理組的細(xì)胞內(nèi)TG含量較正常組均明顯升高(P<0.05)； 3,4-DHAP組及辛伐他汀組細(xì)胞內(nèi)TG含量均比模型組顯著降低(P<0.05)，且3,4-DHAP組細(xì)胞內(nèi)TG含量低于辛伐他汀組(P<0.05)，見圖1B。

Figure 1.Oil red O staining (A；×200) and the intracellular TG content (B) in L02 cells. Mean±SD.n=6.△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group;#P<0.05vssimvastatin group.

圖1L02細(xì)胞油紅O染色及TG含量

2 細(xì)胞AMPK mRNA表達(dá)水平的變化

RT-qPCR結(jié)果可以看出，模型組AMPK mRNA表達(dá)比正常組明顯降低(P<0.05)；3,4-DHAP及辛伐他汀處理后，兩組的AMPK mRNA表達(dá)均比模型組顯著增高(P<0.05)，且3，4-DHAP組AMPK mRNA水平高于辛伐他汀組(P<0.05),見圖2。

3 細(xì)胞AMPK、p-AMPK、p-SREBP-1c和p-ACC蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果可以看出，模型組AMPK及p-AMPK蛋白表達(dá)均比正常組減少(P<0.05)；3,4-DHAP及辛伐他汀處理后，兩組的AMPK及p-AMPK蛋白表達(dá)均比模型組顯著增加(P<0.05)，且3,4-DHAP組高于辛伐他汀組(P<0.05)。與正常組比較，模型組的p-SREBP-1c和p-ACC明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，3,4-DHAP及辛伐他汀組的p-SREBP-1c和p-ACC明顯增加(P<0.05)，且3,4-DHAP組高于辛伐他汀組(P<0.05),見圖3。

Figure 2.The RT-qPCR results of AMPK mRNA expression in L02 cells. Mean±SD.n=6.△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group;#P<0.05vssimvastatin group.

圖2各組L02細(xì)胞AMPKmRNA的表達(dá)

Figure 3.The Western blot results of AMPK, p-AMPK, p-SREBP-1c and p-ACC protein levels in L02 cells. Mean±SD.n=6.△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group;#P<0.05vssimvastatin group.

圖3各組L02細(xì)胞AMPK、p-AMPK、p-SREBP-1c和p-ACC蛋白的表達(dá)

4 肝臟組織冰凍切片油紅O染色及TG含量

與正常組比較，模型組肝臟切片中脂滴增加，TG含量亦增加(P<0.05)；與模型組比較，3,4-DHAP及辛伐他汀組脂滴及TG含量減少(P<0.05)，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

Figure 4.Oil red O staining (A;×40) and the hepatic TG content (B) in rabbits. Mean±SD.n=8.△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

圖4兔肝臟油紅O染色及TG含量

5 肝臟組織中AMPK、p-AMPK、p-SREBP-1c和p-ACC的蛋白表達(dá)

Western blot可以看出，模型組的AMPK及p-AMPK蛋白表達(dá)均低于正常組(P<0.05)；3,4-DHAP及辛伐他汀處理后，2組的AMPK及p-AMPK蛋白表達(dá)均比模型組增加(P<0.05)，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組比較，模型組的p-SREBP-1c及p-ACC明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，3,4-DHAP及辛伐他汀組p-SREBP-1c和p-ACC明顯增加(P<0.05)，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖5。

Figure 5.The Western blot results of AMPK, p-AMPK, p-SREBP-1c and p-ACC protein levels in the liver of rabbits. Mean±SD.n=8.△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

圖5各組兔肝臟組織中AMPK、p-AMPK、p-SREBP-1c和p-ACC蛋白的表達(dá)

討 論

前期工作中，鑒于AS的炎癥反應(yīng)學(xué)說和脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說，我們?cè)诩?xì)胞、ApoE-/-小鼠和新西蘭大白兔3種不同的AS模型上進(jìn)行了抗炎降脂藥理實(shí)驗(yàn)。我們研究的藥物3,4-DHAP是具有活血化瘀作用的傳統(tǒng)中藥禿毛冬青葉的有效成分，以往研究發(fā)現(xiàn)其具有舒張血管，改善血流動(dòng)力學(xué)等作用。而我們?cè)谕肁S模型中發(fā)現(xiàn)3,4-DHAP不僅能減輕斑塊中的炎癥反應(yīng)，還能降低血脂[2]；在ApoE-/-小鼠AS模型中亦有同樣的發(fā)現(xiàn)。但3,4-DHAP的降脂機(jī)制尚不清楚，為此，我們擬研究其降脂機(jī)制。

AMPK途徑是脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)途徑，該途徑被激活后，可降低TC及TG[4]，其調(diào)節(jié)機(jī)制為：(1)失活脂肪酸和TG合成所需關(guān)鍵酶，如ACC，抑制脂肪酸和TG的合成；(2)調(diào)節(jié)激素敏感性脂解酶的活性，促進(jìn)TG降解；(3)調(diào)節(jié)脂肪酸、膽固醇合成過程中的一些轉(zhuǎn)錄因子,如SREBP-1c，降低脂肪酸和TC含量[5]。本研究發(fā)現(xiàn)：3,4-DHAP可增加AMPK的mRNA及蛋白表達(dá)，并能增強(qiáng)其磷酸化過程(即增強(qiáng)活性)，從而降低肝細(xì)胞及肝臟組織的脂質(zhì)含量。AMPK磷酸化后也可以調(diào)節(jié)一些轉(zhuǎn)錄因子，因此，我們對(duì)其下游調(diào)節(jié)因子如SREBP-1c進(jìn)行了研究。SREBP-1c被激活后可進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)節(jié)與肝臟脂肪酸、TG合成有關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄，如ACC、脂肪酸合成酶等，使脂肪酸、TG合成增多；若SREBP-1c被p-AMPK磷酸化之后，入核被抑制，其調(diào)節(jié)作用亦被抑制，導(dǎo)致脂肪酸和TG合成減少[6]。我們發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞及肝臟中，3,4-DHAP能增強(qiáng)SREBP-1c磷酸化過程，該過程可能是上游的AMPK活性增強(qiáng)引起的；SREBP-1c磷酸化增強(qiáng)，入核受抑制，從而導(dǎo)致TG合成減少。另外，多種脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶，如ACC，亦參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程[7]。在脂肪酸合成過程中，ACC是限速酶，有ACC1和ACC22種亞型。ACC1能促進(jìn)脂肪酸合成[8]，被p-AMPK磷酸化后，活性受到抑制，脂肪酸合成減少。ACC1亦是SREBP-1c調(diào)節(jié)的下游靶基因[9]，SREBP-1c磷酸化后失去了調(diào)節(jié)作用。在實(shí)驗(yàn)中，藥物處理后，SREBP-1c磷酸化增加，在基因水平可減少ACC1轉(zhuǎn)錄，我們推測(cè)脂質(zhì)減少一方面與ACC1磷酸化水平增加有關(guān)，另一方也與ACC1基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)減少有關(guān)。另外，我們發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞水平，3,4-DHAP與辛伐他汀的降脂作用有顯著差異，而在整體水平上，兩者降脂作用的差異無顯著性，機(jī)制不清，有待進(jìn)一步研究。此外，脂質(zhì)代謝的其它調(diào)節(jié)途徑，如過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptors-α, PPARα)途徑[10]和肝X受體(liver X receptors，LXRs)途徑[11]等，本研究沒有涉及到，亦有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們?cè)诟渭?xì)胞和肝臟組織中觀察了3,4-DHAP對(duì)脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)途徑——AMPK途徑的影響；研究結(jié)果提示，3,4-DHAP可能通過作用于AMPK途徑，降低肝細(xì)胞及肝臟組織中的TG含量。