抑制Mcl-1表達(dá)調(diào)控結(jié)核感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制初探*

王新敏， 王小芳， 盧 洋， 楊 菩， 韓 玲， 王英姿， 張萬江， 章 樂△

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1第一附屬醫(yī)院泌尿外科， 2病理生理學(xué)教研室， 新疆 石河子 832002)

髓細(xì)胞白血病基因1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)編碼的蛋白是Bcl-2蛋白家族成員，其主要作用是通過維持細(xì)胞線粒體膜的完整性、阻止細(xì)胞色素C的釋放及抑制caspase酶和DNA降解酶的激活進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡[1]。越來越多的證據(jù)表明，Mcl-1基因可能是結(jié)核病潛伏感染預(yù)防與控制的一個很有潛力的靶點。Sly等[2]早期研究發(fā)現(xiàn)，Mcl-1基因可以在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)毒力株H37Rv感染的宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，同時抑制宿主巨噬細(xì)胞的凋亡，而當(dāng)抑制Mcl-1的表達(dá)后，宿主巨噬細(xì)胞的凋亡水平顯著上調(diào)并抑制了毒力株在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活[2]。前期研究也發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Mcl-1的表達(dá)能增加結(jié)核桿菌感染的宿主巨噬細(xì)胞的凋亡，且在結(jié)核桿菌菌株毒力不同時凋亡率存在差異[3]。因此，本研究探討了使用Mcl-1-shRNA質(zhì)粒下調(diào)Mcl-1的表達(dá)在不同處理時間和不同毒力結(jié)核分枝桿菌感染時對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，為結(jié)核病的防控提供更多的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗菌株和動物及質(zhì)粒

實驗所用BCG、結(jié)核分枝桿菌H37Ra和H37Rv由中國藥物生物制品檢定所提供并保存；新疆地區(qū)分離的流行的結(jié)核桿菌菌株XJ-MTB由實驗室早期鑒定并保存。實驗所用小鼠為 8 周齡SPF 級健康雌性BALB/c小鼠，體重(18±2) g，于石河子大學(xué)實驗動物中心購買，許可證編號為SYXK(新)2016-0002。所有關(guān)于動物的研究及操作都是經(jīng)過在實驗前批準(zhǔn)的動物倫理委員會(IAEC)的協(xié)議進(jìn)行的。實驗所用質(zhì)粒是由上海吉凱基因公司構(gòu)建的Mcl-1-shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)本實驗室前期篩選設(shè)計[4]，活化、擴(kuò)增后保存?zhèn)溆谩?/p>

2 主要試劑

10%胎牛血清購于Thermo；RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基購于HyClone；PCR引物的合成和質(zhì)粒的篩選由上海生工生物工程有限公司完成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由北京天根生物科技有限公司提供；鼠抗β-actin單克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗Bcl-2和Bax單克隆抗體購于CST；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于Thermo。

3 方法

3.1實驗分組 將實驗小鼠分為BCG組、H37Ra組、H37Rv組、XJ-MTB組、Mcl-1-shRNA組、BCG+Mcl-1-shRNA組、H37Ra+Mcl-1-shRNA組、H37Rv+Mcl-1-shRNA組、XJ-MTB+Mcl-1-shRNA組和空白對照(control)組，同時將處理后時間設(shè)為1 d、3 d、5 d和7 d 4個時點，每組每個時點各設(shè)3只小鼠。Mcl-1-shRNA質(zhì)粒的劑量為每只75 μg。

3.2結(jié)核分枝桿菌感染小鼠模型的構(gòu)建 室溫下，在生物安全柜內(nèi)，用蘇通培養(yǎng)液與生理鹽水的混合物(0.5 mL；體積比為3∶1)稀釋細(xì)菌，取100 μL細(xì)菌稀釋液涂抹在改良羅氏培養(yǎng)基上。2～3周后，滅菌接種環(huán)取羅氏培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好的結(jié)核分枝桿菌菌落，置于滅菌的磨菌器中，加入少量含有0.05% Tween-80的生理鹽水充分研磨，使其成均勻渾濁的菌懸液。將細(xì)菌懸液按照麥?zhǔn)媳葷岱ǖ臉?biāo)準(zhǔn)調(diào)整至1.0×1010CFU/L。將0.3 mL的菌懸液通過小鼠腹腔注射的方式注射到對應(yīng)分組的小鼠體內(nèi)[4]。將感染后的小鼠置于生物安全三級實驗室內(nèi)，IVC 籠具中飼養(yǎng)。在對應(yīng)的時點將前期篩選并構(gòu)建好的Mcl-1-shRNA[5]質(zhì)粒采用水動力轉(zhuǎn)染(hydrodynamic transfection)技術(shù)注入各組小鼠體內(nèi)[6]。

3.3小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的收集與提取 室溫下，于上述不同的時點，將各組小鼠脫頸處死后，用75%乙醇消毒小鼠腹部皮膚，置于超凈臺中；用無菌的鑷子將小鼠下腹部皮膚提起撕開后向小鼠腹腔中注入5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基，反復(fù)按摩腹部約10 min，避開腸和脂肪，不同的方向反復(fù)抽吸數(shù)次并收集所有吸出的腹腔液,1 200 r/min離心5 min，棄上清，PBS液洗滌1次，用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)將細(xì)胞重懸；將收集處理好的細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，貼壁細(xì)胞即為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞[7-8]。

3.4應(yīng)用Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒檢測小鼠巨噬細(xì)胞凋亡 將各組小鼠于上述不同時點提取并培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。按照Annexin V-APC/7-AAD凋亡試劑盒的說明步驟進(jìn)行操作，先將收集的巨噬細(xì)胞用冷的PBS 洗滌 2 次，再用預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)至 1×109/L，每管加入100 μL細(xì)胞懸液、5 μL 的Annexin V-APC和10 μL 7-AAD，混合后避光放置于冰上靜置 30 min，最后每管加入 400 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer，30 min 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡率。

3.5Real-time PCR檢測Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá) 將收集提取的各組小鼠腹腔液放入離心機(jī)中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入2 mL PBS重懸細(xì)胞，離心洗滌2次，吸取1 mL TRIzol，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，再將細(xì)胞懸液移入1.5 mL EP管內(nèi)，提取細(xì)胞總RNA。將提取的總RNA在NanoDrop 2000紫外分光光度計測量260 nm和280 nm下RNA的吸光度并計算其濃度，然后通過電泳檢測其質(zhì)量。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物的設(shè)計與合成由上海生工完成。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 為 5 min; 95 ℃ 10 s, 57 ℃ 30 s，40個循環(huán)。引物序列見表1。樣本按照QuantiFast SYBR Green PCR Kit 試劑盒步驟擴(kuò)增。以熔解曲線確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。以β-actin為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計算Bcl-2和Bax的mRNA相對表達(dá)量。

表1 Real-time PCR的引物序列

F: forward; R: reverse.

3.6Western blot檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá) 于上述不同時點收集并提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，然后用蛋白裂解液裂解對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行裂解，繼而分別提取各組細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA 法對蛋白濃度進(jìn)行測定及配平，10% SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)，半干電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上(23 V、40 min)，室溫封閉 2 h，分別與兔抗鼠Bcl-2(1∶10 000)和Bax(1∶20 000)多克隆抗體反應(yīng)后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)的II 抗孵育 1 h，ECL 法顯色壓片曝光，用凝膠成像儀分析系統(tǒng)對 Western blot 檢測條帶進(jìn)行灰度值掃描，計算Bcl-2或Bax與β-actin吸光度比值，進(jìn)行半定量統(tǒng)計學(xué)分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，實驗所得數(shù)據(jù)資料進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，應(yīng)用SNK-q檢驗進(jìn)行兩兩比較；計數(shù)資料或計量資料不服從正態(tài)性且方差不齊時采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Mcl-1-shRNA處理的宿主巨噬細(xì)胞的凋亡率與感染的MTB菌株毒力有關(guān)

結(jié)核分枝桿菌感染宿主巨噬細(xì)胞后，可以誘導(dǎo)和調(diào)控宿主巨噬細(xì)胞凋亡水平，且宿主巨噬細(xì)胞的凋亡水平因感染的結(jié)核桿菌菌株的毒力不同而有差異[9-10]。因此，本研究將Mcl-1-shRNA分別作用于經(jīng)BCG、H37Ra、H37Rv和XJ-MTB感染的小鼠，用Annexin V-APC/7-AAD雙參數(shù)法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測了不同時點各處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，不同毒力結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡水平在4個時點均顯著增高(P<0.05);其中BCG和H37Ra的凋亡率高于其它菌株感染組。Mcl-1-shRNA質(zhì)粒處理后，與未處理的結(jié)核桿菌感染組相比，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡率均呈現(xiàn)不同程度的增高，并于處理后的第5天增高最為顯著(P<0.05)。H37Ra組和BCG組的凋亡水平高于XJ-MTB組和H37Rv組(P<0.05)，其趨勢為BCG組最高，H37Ra組次之，H37Rv和XJ-MTB組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，但低于H37Ra組(P<0.05)，說明小鼠巨噬細(xì)胞的凋亡水平與感染的結(jié)核分枝桿菌的毒力有關(guān)，見圖1。

2 Mcl-1-shRNA處理顯著減少了Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)

將Mcl-1-shRNA分別作用于經(jīng)不同毒力的結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠后，real-time PCR和Western blot分別檢測了不同時點各處理組提取的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)。Real-time PCR的結(jié)果顯示，與空白對照組相比，不同毒力結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bcl-2的mRNA表達(dá)水平均有不同程度的增加(P<0.05);應(yīng)用Mcl-1-shRNA質(zhì)粒處理后，各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bcl-2的mRNA表達(dá)水平均有不同程度的降低(P<0.05)，其中Bcl-2的表達(dá)在未感染組中降低最不明顯，Mcl-1-shRNA質(zhì)粒處理的H37Ra組和BCG組中Bcl-2的表達(dá)量最低，且低于XJ-MTB組和H37Rv組，但其下調(diào)趨勢基本相同(P<0.05),見圖2A。Western blot的結(jié)果顯示，與空白對照組相比，不同毒力結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均有不同程度的增高(P<0.05)；應(yīng)用Mcl-1-shRNA質(zhì)粒處理后，各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平均有不同程度的降低(P<0.05)，其中Bcl-2的表達(dá)在未感染組中降低最不明顯，H37Ra組和BCG組中Bcl-2的下調(diào)趨勢稍弱于XJ-MTB組和H37Rv組(P<0.05)，見圖2B。

Figure 1.The effect of Mcl-1-shRNA on the apoptotic rate of mouse peritoneal macrophages infected with different virulence of MTB strains for 1 d, 3 d, 5 d and 7 d. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsBCG, H37Ra, H37Rv or XJ-MTB group;▲P<0.05vsMcl-1-shRNA group;△P<0.05vsH37Rv+Mcl-shRNA or XJ-MTB+Mcl-shRNA group.

圖1Mcl-1-shRNA處理對經(jīng)不同毒力的結(jié)核桿菌菌株感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡率的影響

3 Mcl-1-shRNA處理顯著增加了Bax的mRNA和蛋白的表達(dá)

將Mcl-1-shRNA質(zhì)粒分別作用于經(jīng)不同毒力的結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠后，real-time PCR和Wes-tern blot檢測不同時點各處理組提取的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bax的mRNA表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果顯示，與空白對照組相比，不同毒力結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bax的mRNA表達(dá)水平均有不同程度的增高(P<0.05);應(yīng)用Mcl-1-shRNA質(zhì)粒處理后，各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bax的mRNA表達(dá)水平均有不同程度的升高(P<0.05)，其中H37Ra組和BCG組中Bax的上升趨勢較XJ-MTB組和H37Rv組稍強(qiáng)，見圖3A。Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，不同毒力結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)水平均有不同程度的增高(P<0.05)；應(yīng)用Mcl-1-shRNA質(zhì)粒處理后，各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平均有不同程度的升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中H37Ra組和BCG組中Bax的上升趨勢較XJ-MTB組和H37Rv組稍強(qiáng)，見圖3B。

Figure 2.The effects of Mcl-1-shRNA on the expression of Bcl-2 at mRNA and protein levels in the mouse peritoneal macrophages infected with different virulence of MTB strains determined by real-time PCR and Western blot. A: the mRNA expression of Bcl-2; B: the protein expression of Bcl-2. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsuntreated group.

圖2Real-timePCR和Westernblot法檢測Mcl-1-shRNA處理對經(jīng)不同毒力結(jié)核桿菌菌株感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)的影響

Figure 3.The effects of Mcl-1-shRNA on the expression of Bax at mRNA and protein levels in the mouse peritoneal macrophages infected with different virulence of MTB strains determined by real-time PCR and Western blot. A: the mRNA expression of Bax; B: the protein expression of Bax. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntreated group;#P<0.05vsuntreated group.

圖3Real-timePCR和Westernblot檢測Mcl-1-shRNA處理對經(jīng)不同毒力結(jié)核桿菌菌株感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bax表達(dá)的影響

4 Bcl-2/Bax比值在結(jié)核感染的巨噬細(xì)胞中的變化

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的存亡與Bcl-2/Bax比值密切相關(guān)[11]。因此，因此我們檢測了Mcl-1-shRNA質(zhì)粒對不同毒力的結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bcl-2/Bax mRNA和蛋白比值的影響。Bcl-2/Bax mRNA的比值在Mcl-1-shRNA質(zhì)粒處理后隨著時間的延長而逐漸增加，其中H37Rv和XJ-MTB組稍高于BCG和H37Ra組(P<0.05)，而H37Rv組與XJ-MTB組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4A。Bcl-2/Bax蛋白的比值在Mcl-1-shRNA處理后隨時間的延長先減少再增加，各組比值之間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4B。

Figure 4.The effects of Mcl-1-shRNA on the Bcl-2/Bax ratio at mRNA and protein levels in the mouse peritoneal macrophages infected with different virulence of MTB strains determined by real-time PCR and Western blot. A: the Bcl-2/Bax ratio at mRNA level; B: the Bcl-2/Bax ratio at protein level. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsBCG+Mcl-1-shRNA or H37Ra+Mcl-1-shRNA group.

圖4Real-timePCR和Westernblot檢測Mcl-1-shRNA處理對經(jīng)不同毒力結(jié)核桿菌菌株感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bcl-2/Bax比值的影響

討 論

細(xì)胞凋亡和程序性細(xì)胞死亡是指生物體為維持機(jī)體內(nèi)環(huán)鏡的穩(wěn)定，細(xì)胞在一定的病理和生理條件下，由基因控制的、高度有序的并由一系列酶活動參與的細(xì)胞自主性死亡，它是一種高度保守的、被精確調(diào)節(jié)的被動過程[12]。結(jié)核分枝桿菌感染宿主巨噬細(xì)胞后，通過降低宿主巨噬細(xì)胞的凋亡率來逃避巨噬細(xì)胞的殺傷，且不同毒力的結(jié)核桿菌菌株通過調(diào)控宿主巨噬細(xì)胞的凋亡來逃避宿主巨噬細(xì)胞的殺傷[9-10]。在本研究中，流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示，不同毒力的結(jié)核分枝桿菌菌株感染小鼠巨噬細(xì)胞后，宿主巨噬細(xì)胞的凋亡率以弱毒力的BCG和H37Ra菌株高于強(qiáng)毒株H37Rv組。此結(jié)果與Balcewicz-Sablinska等[13]利用H37Rv和H37Ra在實驗中分別來感染人肺泡巨噬細(xì)胞后H37Ra組凋亡率高，而H37Rv組巨噬細(xì)胞的凋亡率受到明顯抑制的研究結(jié)果一致。除此之外，在處理后的第5天結(jié)核桿菌感染的宿主巨噬細(xì)胞的凋亡率最高，此結(jié)果也與本實驗組前期研究結(jié)果吻合。我們推測出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是：(1)結(jié)核分枝桿菌的某些菌體成分及其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的代謝活動可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，促使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)；(2)結(jié)核分枝桿菌毒力株的某些特殊菌體成分和其分泌的某些物質(zhì)激活了凋亡通路的某些因子以抑制細(xì)胞的凋亡，從而逃避宿主巨噬細(xì)胞的殺傷。因此，結(jié)核分枝桿菌毒力株對巨噬細(xì)胞凋亡的抑制可能是結(jié)核分枝桿菌抵抗機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷的一種重要機(jī)制。相關(guān)證實，結(jié)核分枝桿菌菌株的毒力因素對于其感染的宿主巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控至關(guān)重要。

Mcl-1屬于Bcl-2家族的抗凋亡成員，當(dāng)下調(diào)Mcl-1的表達(dá)后，將會對不同毒力的結(jié)核分枝桿菌感染的宿主巨噬細(xì)胞的凋亡有何影響呢？當(dāng)利用Mcl-1-shRNA質(zhì)粒抑制Mcl-1的表達(dá)后，宿主巨噬細(xì)胞的凋亡率顯著增加，同樣地，弱毒力的BCG和H37Ra菌株處理組小鼠巨噬細(xì)胞的凋亡率稍高于強(qiáng)毒株H37Rv處理組，且隨著時間的延長逐漸增加，在處理后的第5天凋亡率最高。出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能有2個方面：(1)下調(diào)Mcl-1的表達(dá)可能激活了巨噬細(xì)胞凋亡的某些信號通路，從而促進(jìn)了宿主巨噬細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)；(2)Mcl-1有可能被有活性的毒力株誘導(dǎo)，而減毒株或無毒力的菌株不能誘導(dǎo)Mcl-1的表達(dá)。此數(shù)據(jù)結(jié)果表明，抑制Mcl-1的表達(dá)對結(jié)核分枝桿菌感染的宿主巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制可能與巨噬細(xì)胞凋亡信號通路和MTB菌株的毒力密切相關(guān)。

而有研究發(fā)現(xiàn)，對細(xì)胞凋亡某個程序或環(huán)節(jié)的抑制并不是通過Bcl-2的抗凋亡作用實現(xiàn)的，而是通過改變細(xì)胞凋亡的閾值，而細(xì)胞凋亡的閾值由Bcl-2與Bax的比值所決定，二者的比值亦對細(xì)胞的存亡起著重要作用，并且線粒體為二者相互作用的靶細(xì)胞器[14-15]。二者作為Bcl-2家族中最重要的成員,其作用不僅取決于本身表達(dá)水平的高低,還與二者之間的比例有關(guān)。通常情況下Bax與Bcl-2改變各自整合入膜所需構(gòu)象形成異源二聚體Bax-Bcl-2[11],此時不能形成膜通道,從而促進(jìn)了細(xì)胞存活,抑制了細(xì)胞凋亡;而當(dāng)Bax增多時,則以Bax本身形成的同源二聚體Bax-Bax為主,促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。在凋亡信號刺激下，Bax會從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上形成同源二聚體,通過線粒體通透性的改變,使線粒體釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入胞漿中,從而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[1]。本研究中我們檢測了各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Bcl-2和Bax的表達(dá)，結(jié)果顯示，不同毒力MTB感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞均可不同程度地誘導(dǎo)Bcl-2及Bax mRNA和蛋白的表達(dá)，其中強(qiáng)毒株較弱毒株更能明顯地誘導(dǎo)Bcl-2，而弱毒株較強(qiáng)毒株更能明顯地激活Bax；應(yīng)用不同處理方式沉默抗凋亡基因Mcl-1后，各組宿主巨噬細(xì)胞中Bax的表達(dá)明顯被上調(diào)，而Bcl-2的表達(dá)被不同程度的抑制，其中Bcl-2與Bax于處理前后表達(dá)水平的變化以H37Ra組、BCG組最為顯著。由此可見，Bcl-2/Bax比值與感染的MTB的毒力相關(guān)，并且為負(fù)相關(guān)，沉默或阻斷Mcl-1在不同毒力MTB感染的宿主細(xì)胞中的表達(dá)，可誘導(dǎo)調(diào)控Bcl-2及Bax的表達(dá)。因而，我們認(rèn)為在MTB感染的宿主細(xì)胞中抗凋亡基因Mcl-1可通過與Bcl-2及Bax的相互作用調(diào)控宿主細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，應(yīng)用Mcl-1-shRNA質(zhì)粒抑制Mcl-1的表達(dá)可顯著促進(jìn)不同毒力MTB菌株感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡，其調(diào)控機(jī)制可能與Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)和MTB菌株毒力密切相關(guān)。對抑制Mcl-1調(diào)控結(jié)核感染的宿主巨噬細(xì)胞凋亡的研究將為結(jié)核病的預(yù)防與控制提供更多的策略與理論依據(jù)。然而，本研究對于其調(diào)控機(jī)制的探索僅僅是初步的，后續(xù)的實驗中將會對此進(jìn)行深入研究。