SIRT6對(duì)小鼠米色脂肪細(xì)胞適應(yīng)性產(chǎn)熱功能的影響*

韓在祺， 崔佰吉， 馮 波， 姚 璐

(吉林醫(yī)藥學(xué)院， 吉林 吉林 132013)

目前，中國(guó)已經(jīng)成為全球肥胖人口最多的國(guó)家[1]。肥胖不僅引起糖脂代謝紊亂、脂肪因子分泌異常和慢性低度炎癥反應(yīng)，還會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、腸道菌群失調(diào)和自噬功能受損等異常，同時(shí)，肥胖還是誘發(fā)2型糖尿病、心血管疾病和多種腫瘤的重要危險(xiǎn)因素[2-3]。遺憾的是，目前仍缺乏有效的方法來(lái)預(yù)防和治療肥胖。

能量攝入超過(guò)能量消耗，過(guò)剩能量以甘油三酯形式儲(chǔ)存于脂肪細(xì)胞的脂滴中，長(zhǎng)此以往就會(huì)導(dǎo)致肥胖[4]。研究者利用正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，成人體內(nèi)存在具有適應(yīng)性產(chǎn)熱潛能的脂肪細(xì)胞，白色脂肪組織中的米色脂肪細(xì)胞(beige fat cells)受到冷刺激或β3-腎上腺素能受體激動(dòng)劑CL316,243的誘導(dǎo)后會(huì)進(jìn)行適應(yīng)性產(chǎn)熱，即解偶聯(lián)氧化磷酸化，使儲(chǔ)存于ATP高能磷酸鍵中的化學(xué)能以熱能形式散失[5-6]。米色脂肪細(xì)胞可以通過(guò)增加能量消耗，使能量動(dòng)態(tài)平衡向負(fù)平衡轉(zhuǎn)變，從而抑制肥胖，“白色脂肪米色化”成為人類戰(zhàn)勝肥胖的新希望[7-10]。尋找促進(jìn)“白色脂肪米色化”的有效干預(yù)靶點(diǎn)并進(jìn)行藥物研發(fā)，有望成為治療肥胖及其相關(guān)代謝性疾病的新方法。隨著研究的深入，越來(lái)越多的基因和信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控白色脂肪米色化，但確切的調(diào)控機(jī)制仍有待闡明[11]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子6(silent information regulator 6, SIRT6)是NAD+依賴的去乙?；竤irtuins家族的一員，具有NAD+依賴的蛋白去乙?；富钚院蛦蜛DP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，主要定位于細(xì)胞核中[12]。Sirt6基因敲除小鼠出生時(shí)表型正常，但是隨著生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)出現(xiàn)致死性低血糖、淋巴細(xì)胞明顯減少、皮下脂肪缺失和脊柱彎曲等缺陷，最終在出生4周左右死亡[13]。對(duì)Sirt6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SIRT6會(huì)抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ)下游基因的表達(dá)，與野生型小鼠相比，Sirt6轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)臟脂肪的含量明顯減少，胰島素敏感性顯著提高[14],這些研究結(jié)果提示SIRT6可能在脂肪組織中參與調(diào)控糖脂代謝。脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠會(huì)因抑制脂肪分解而易感高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖[15]。此外，棕色脂肪組織中定位于PPARγ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α，PGC-1α)啟動(dòng)子區(qū)的SIRT6會(huì)通過(guò)招募磷酸化的活化轉(zhuǎn)錄因子2(activating transcription factor 2，ATF2)促進(jìn)PGC-1α表達(dá)，但是，米色脂肪細(xì)胞中SIRT6調(diào)節(jié)對(duì)能量代謝的調(diào)控作用及其機(jī)制仍有待研究[16]。

PGC-1α是一種轉(zhuǎn)錄輔激活因子，通過(guò)特異性結(jié)合不同的轉(zhuǎn)錄因子參與多種能量代謝過(guò)程[17]。PGC-1α是調(diào)控適應(yīng)性產(chǎn)熱的關(guān)鍵因子，其表達(dá)水平受β3-腎上腺素信號(hào)通路的調(diào)控，冷刺激或CL316,243通過(guò)激活β3-腎上腺素信號(hào)通路促進(jìn)PGC-1α表達(dá)；作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄輔激活因子，PGC-1α通過(guò)與其它轉(zhuǎn)錄因子[PPARγ、干擾素調(diào)節(jié)因子4(interferon regulatory factor 4，IRF4)和PPARα等]相互作用而促進(jìn)解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein-1，UCP1；又名增溫素)等產(chǎn)熱基因的表達(dá)[18-19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α的活性會(huì)受其磷酸化和乙?；降挠绊?，AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和SIRT1分別可以通過(guò)磷酸化和去乙?；鰪?qiáng)PGC-1α的轉(zhuǎn)錄輔激活活性[20-21],但是通過(guò)翻譯后修飾激活PGC-1α轉(zhuǎn)錄輔激活活性的上游信號(hào)通路仍有待進(jìn)一步研究。

本研究主要以小鼠原代米色脂肪細(xì)胞為模型，探討SIRT6對(duì)小鼠原代米色脂肪能量代謝的影響，并研究SIRT6對(duì)PGC-1α乙?；降恼{(diào)控作用，進(jìn)一步明確米色脂肪細(xì)胞中SIRT6調(diào)控適應(yīng)性產(chǎn)熱的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

人胚胎腎293細(xì)胞HEK293A(本實(shí)驗(yàn)室保存)；質(zhì)粒抽提試劑盒(天根公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher Scientific)；抗SIRT6、乙酰化的賴氨酸抗體(Cell Signal Technology)；抗PGC-1α抗體(Millipore和武漢三鷹公司)；抗Flag和Myc抗體、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、羅格列酮、吲哚美辛和三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3)(Sigma)；抗tubulin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗和ECL檢測(cè)試劑盒(康為試劑公司)；蛋白質(zhì)定量試劑盒、雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒和qPCR Mix(Promega)；DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基(Gibco)。

2 方法

2.1真核表達(dá)載體及重組腺病毒的構(gòu)建 利用PCR擴(kuò)增小鼠Sirt6和Ppargc1a基因的cDNA序列，并將其插入到pcDNA4/Myc-His載體中，構(gòu)建表達(dá)融合蛋白SIRT6-Myc和HA-PGC-1α的真核表達(dá)載體。H133Y是沒(méi)有催化活性的SIRT6突變體，設(shè)計(jì)引物對(duì)Sirt6 cDNA序列進(jìn)行定點(diǎn)突變后，過(guò)表達(dá)H133Y真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法與過(guò)表達(dá)SIRT6真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法完全相同。構(gòu)建重組腺病毒Ad-Flag-Sirt6和Ad-GFP的方法與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]。

2.2白色脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)及小鼠原代米色脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 C57BL/6小鼠拉頸處死，取出腹股溝處的脂肪墊，將脂肪墊剪碎并移至含有膠原酶Ι的工作液中消化，濾網(wǎng)過(guò)濾，濾后的工作液經(jīng)離心除去上清，沉淀即為白色脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞。用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸沉淀，并均勻分至培養(yǎng)板中，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待間充質(zhì)干細(xì)胞達(dá)到100%融合，將原培養(yǎng)基更換為添加1 μmol/L地塞米松、850 nmol/L胰島素、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L羅格列酮、125 nmol/L吲哚美辛和1 nmol/L T3的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，再將培養(yǎng)基更換為添加850 nmol/L胰島素、1 μmol/L羅格列酮和1 nmol/L T3的DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d后，即為分化成熟的小鼠原代米色脂肪細(xì)胞。同時(shí)，檢測(cè)分化成熟的小鼠原代米色脂肪細(xì)胞中米色脂肪細(xì)胞標(biāo)志性基因Cd137和Tmem26的表達(dá)情況。

2.3免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)實(shí)驗(yàn)和免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)實(shí)驗(yàn) Co-IP和IP實(shí)驗(yàn)的操作方法基本相同，轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)SIRT6-Myc、H133Y-Myc和HA-PGC-1α真核表達(dá)載體的HEK293A細(xì)胞、小鼠原代米色脂肪細(xì)胞及感染腺病毒Ad-Flag-Sirt6或Ad-GFP的小鼠原代米色脂肪細(xì)胞，利用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。細(xì)胞總蛋白經(jīng)對(duì)照IgG和Protein A/G瓊脂糖珠預(yù)處理后，留少量總蛋白作為Input，剩余蛋白樣品均分2份，一份加入抗目的蛋白抗體，另一份加入相應(yīng)IgG作為對(duì)照，4 ℃孵育過(guò)夜后，加入Protein A/G瓊脂糖珠繼續(xù)孵育2 h，離心收集Protein A/G瓊脂糖珠，用PBS洗滌5次，最后用電泳加樣緩沖液重懸Protein A/G瓊脂糖珠后，煮沸10 min，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩＠肅o-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SIRT6與PGC-1α的相互作用，用抗SIRT6抗體進(jìn)行IP，用抗PGC-1α抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，反之則反。利用IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGC-1α的乙酰化水平，用抗PGC-1α抗體進(jìn)行IP，用抗乙酰化的賴氨酸抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 配制10% SDS-PAGE，取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫孵育1 h，將PVDF膜孵育相應(yīng)的I抗稀釋液，4 ℃孵育過(guò)夜，用1×TBST漂洗5次，每次10 min。室溫下，用HRP標(biāo)記的II抗稀釋液孵育PVDF膜2 h，再用1×TBST漂洗4次，每次10 min。最后，利用ECL發(fā)光，X線片曝光、顯影、定影。

2.5油紅O染色實(shí)驗(yàn) 除去培養(yǎng)液并用PBS漂洗細(xì)胞后，加10%中性甲醛固定細(xì)胞。配制染色液(稱取預(yù)先研磨粉碎的0.5 g油紅干粉，溶于少量異丙醇中，然后加異丙醇至100 mL，米色瓶密封或錫箔紙包裹避光，4 ℃保存，此為儲(chǔ)存液，可長(zhǎng)期保存，用時(shí)取6 mL儲(chǔ)存液加雙蒸水4 mL混勻，定性濾紙過(guò)濾后即為染色液)，除去培養(yǎng)皿中的10%中性甲醛并加入染色液，染色10 min。用60%異丙醇漂洗脫色，晾干后，使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

2.6雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 小鼠Ucp1增強(qiáng)子區(qū)為約2 kb的序列，該序列中包含PPAR反應(yīng)元件(PPAR response element, PPRE)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后插入到pGL3-Basic質(zhì)粒中。將HEK293A細(xì)胞接種到24孔板中，培養(yǎng)約18 h，細(xì)胞密度達(dá)到約80%，共轉(zhuǎn)染SIRT6質(zhì)粒、PGC-1α質(zhì)粒、螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒和海腎螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒，并用pEGFP-C1質(zhì)粒調(diào)平轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的總質(zhì)量。轉(zhuǎn)染48 h后，吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，吸凈殘留液體。每孔加入80 μL被動(dòng)裂解液，室溫裂解30 min。吸取20 μL上清加入到測(cè)試板中，并利用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)讀值。相對(duì)螢光素酶活性=螢火蟲(chóng)螢光素酶讀值/海腎螢光素酶讀值。

2.7Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 使用TRIzol試劑從小鼠原代米色脂肪細(xì)胞中分離純化總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成cDNA第1條鏈。利用基因特異性引物和SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR預(yù)混液，使用實(shí)時(shí)定量PCR儀對(duì)新合成的cDNA進(jìn)行分析測(cè)定。利用2-ΔΔCt循環(huán)閾值方法分析數(shù)據(jù)。測(cè)定各目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平時(shí)以Rps18作為內(nèi)參照基因，各組實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)基因的mRNA水平表示為對(duì)照組表達(dá)量的數(shù)倍。所用引物的序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物的核苷酸序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)表示為3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)。兩組間比較采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)；多組間多重比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，之后各組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SIRT6增強(qiáng)小鼠原代米色脂肪細(xì)胞適應(yīng)性產(chǎn)熱

經(jīng)體外誘導(dǎo)分化獲得成熟的小鼠原代米色脂肪細(xì)胞，且其標(biāo)志性基因Cd137和Tmem26的mRNA表達(dá)水平均高于棕色和白色脂肪細(xì)胞，見(jiàn)圖1A。將米色脂肪細(xì)胞感染重組腺病毒Ad-GFP和Ad-Flag-Sirt6，24 h 后利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表達(dá)情況，可見(jiàn)綠色熒光強(qiáng)度基本一致，說(shuō)明2組細(xì)胞感染重組腺病毒的程度相近,見(jiàn)圖1B。通過(guò)油紅O染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2組細(xì)胞的脂滴大小和密度基本一致，說(shuō)明SIRT6不參與調(diào)控脂肪分化，見(jiàn)圖1B。利用Seahorse能量代謝分析儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， SIRT6上調(diào)小鼠原代米色脂肪細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧速率；寡霉素(oligomycin)作為一種ATP合酶抑制劑會(huì)阻斷ATP產(chǎn)生，結(jié)果顯示SIRT6會(huì)增強(qiáng)適應(yīng)性產(chǎn)熱功能；FCCP是一種解偶聯(lián)劑，反映細(xì)胞的最大耗氧能力，從圖中可以看出，SIRT6會(huì)增大細(xì)胞的呼吸潛能(P<0.01)，見(jiàn)圖1C。此外，與感染Ad-GFP對(duì)照組相比，感染Ad-Flag-Sirt6重組腺病毒使小鼠原代米色脂肪細(xì)胞中Sirt6的表達(dá)量顯著上調(diào)，過(guò)表達(dá)SIRT6可以明顯誘導(dǎo)Ucp1、Dio2和Elovl3等適應(yīng)性產(chǎn)熱基因的表達(dá)上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖1D。

Figure 1.SIRT6 stimulated adaptive thermogenesis in mouse primary beige fat cells. A: relative mRNA expression of beige fat cell-specific markersCd137 andTmem26 was measured by real-time PCR in differentiated brown, beige and white fat cells; B: the infection rate (upper panel, ×400) and oil red O staining (lower panel,×40) of control and SIRT6-expressing primary beige fat cells; C: continuous measurement of oxygen consumption rate (OCR) in control and SIRT6-expressing primary beige fat cells. Oxygen consumption was performed under basal conditions, followed by the addition of oligomycin (1 μmol/L), the pharmacological uncoupler FCCP (2 μmol/L) or the Complex III and I inhibitor antimycin A and rotenone (0.5 μmol/L each); D: relative mRNA expression ofSirt6,Ucp1,Dio2 andElovl3 in primary beige fat cells infected with Ad-GFP and Ad-Flag-Sirt6 was measured using real-time PCR. Mean±SD.n=4.#P<0.05vsbrown adipocyte group and white adipocyte group;*P<0.05,**P<0.01vsAd-GFP group.

圖1SIRT6增強(qiáng)小鼠原代米色脂肪細(xì)胞適應(yīng)性產(chǎn)熱

2 HEK293A細(xì)胞中外源SIRT6和PGC-1α存在相互作用

PGC-1α是一個(gè)非常重要的影響能量代謝的調(diào)控因子，考慮到與SIRT6同屬一個(gè)家族的SIRT1能夠通過(guò)去乙酰化PGC-1α調(diào)節(jié)其活性，我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探索SIRT6與PGC-1α之間的相互作用情況[17, 21]。將轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)SIRT6-Myc、HA-PGC-1α和GFP重組質(zhì)粒的HEK293A細(xì)胞，提取總蛋白后進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源性的SIRT6和PGC-1α存在相互作用，見(jiàn)圖2A、B。此外，對(duì)轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染HA-PGC-1α、SIRT6-Myc或H133Y-Myc重組質(zhì)粒的HEK293A細(xì)胞進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SIRT6的突變體H133Y與PGC-1α之間不存在相互作用，見(jiàn)圖2C。

Figure 2.There was an interaction between exogenous SIRT6 and PGC-1α in HEK293A cells. Co-IP assays of exogenous PGC-1α with exogenous SIRT6 (A), exogenous SIRT6 with exogenous PGC-1α (B), and exogenous PGC-1α with exogenous SIRT6-Myc and H133Y-Myc (C) were performed.

圖2HEK293A細(xì)胞中外源性的SIRT6與PGC-1α存在相互作用

3 小鼠原代米色脂肪細(xì)胞中SIRT6與PGC-1α存在相互作用

小鼠原代米色脂肪細(xì)胞感染Ad-GFP和Ad-Flag-Sirt6后，進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源性SIRT6與內(nèi)源性PGC-1α存在相互作用，見(jiàn)圖3A。進(jìn)一步對(duì)小鼠原代米色脂肪細(xì)胞進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，內(nèi)源性SIRT6與PGC-1α仍存在相互作用，見(jiàn)圖3B。

Figure 3.There was an interaction between SIRT6 and PGC-1α in mouse primary beige fat cells. A: Co-IP of endogenous PGC-1α with Flag-Sirt6 and Co-IP of exogenous SIRT6 with endogenous PGC-1α from primary beige fat cells infected with Ad-GFP or Ad-Flag-Sirt6; B: Co-IP of endogenous PGC-1α with endogenous SIRT6 from subcutaneous fat pads.

圖3小鼠原代米色脂肪細(xì)胞中SIRT6與PGC-1α存在相互作用

4 SIRT6通過(guò)去乙?；疨GC-1α增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄共激活活性

SIRT6具有去乙酰化酶活性，而去乙酰化PGC-1α?xí)鰪?qiáng)其活性，因此我們利用IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGC-1α的乙酰化水平，以探索SIRT6對(duì)PGC-1α的調(diào)控機(jī)制。HEK293A細(xì)胞轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)SIRT6-Myc、H133Y-Myc、HA-PGC-1α或GFP的重組質(zhì)粒后，提取總蛋白進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SIRT6會(huì)降低外源性PGC-1α的乙?；?，而SIRT6的無(wú)活性突變體H133Y則無(wú)此作用,見(jiàn)圖4A。小鼠原代米色脂肪細(xì)胞感染Ad-GFP或Ad-Flag-Sirt6后，進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SIRT6會(huì)去乙?；瘍?nèi)源性PGC-1α,見(jiàn)圖4B。

Ucp1增強(qiáng)子含有PPRE，PPARγ與PPRE結(jié)合，PGC-1α通過(guò)與PPARγ結(jié)合發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄輔激活活性，促進(jìn)Ucp1轉(zhuǎn)錄[21]。利用PCR擴(kuò)增小鼠Ucp1增強(qiáng)子含PPRE的序列，并將其插入到螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-Basic啟動(dòng)子區(qū)域，構(gòu)建重組螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒并進(jìn)行雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果表明PGC-1α?xí)龠M(jìn)Ucp1的轉(zhuǎn)錄，并且SIRT6會(huì)協(xié)同增強(qiáng)PGC-1α的轉(zhuǎn)錄輔激活活性,見(jiàn)圖4C。

Figure 4.SIRT6 activated transcriptional coactivator PGC-1α through deacetylation of PGC-1α in mouse primary beige fat cells. A: the effects of SIRT6 and H133Y on PGC-1α acetylation were measured in HEK293A cells cotransfected with GFP, PGC-1α, SIRT6 and H133Y plasmids; B: the effects of SIRT6 on PGC-1α acetylation were measured in mouse primary beige fat cells infected with Ad-GFP or Ad-Flag-Sirt6; C: fragments of theUcp1 promoter fused to a luciferase reporter were cotransfected into HEK293A cells together with GFP plasmid (control) or SIRT6 in the presence or absence of a PGC-1a expression plasmid, and the luciferase activity was corrected forRenillaluciferase activity and normalized to control activity. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsGFP group;#P<0.05vsPGC-1α group.

圖4SIRT6通過(guò)去乙酰化PGC-1α增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄共激活活性

討 論

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為米色脂肪細(xì)胞中SIRT6可通過(guò)去乙?；疨GC-1α上調(diào)其轉(zhuǎn)錄共激活活性，使PGC-1α下游適應(yīng)性產(chǎn)熱基因的表達(dá)升高，并通過(guò)增強(qiáng)適應(yīng)性產(chǎn)熱使米色脂肪細(xì)胞的能量消耗增多。研究發(fā)現(xiàn)，棕色脂肪組織中SIRT6可以通過(guò)招募磷酸化的ATF2結(jié)合到Ppargc1a啟動(dòng)子而增加PGC-1α表達(dá)，從而促進(jìn)適應(yīng)性產(chǎn)熱[23]。棕色脂肪細(xì)胞和米色脂肪細(xì)胞是2種不同的脂肪細(xì)胞，由不同的前體脂肪細(xì)胞分化而來(lái)，基因表達(dá)譜有很大差別，因此，SIRT6雖在2種脂肪細(xì)胞中均發(fā)揮調(diào)控能量代謝的重要作用，但是具體的調(diào)控機(jī)制并不相同[19]。

Dominy等[24]發(fā)現(xiàn) SIRT6會(huì)通過(guò)激活乙?；竿ㄓ每刂品且种频鞍?(general control nonrepressed protein 5, GCN5)使其乙?；疨GC-1α，從而抑制肝臟糖異生，但是Yang等[25]研究卻發(fā)現(xiàn)，在肝臟中敲低SIRT6會(huì)抑制PGC-1α的表達(dá)。因此，在肝臟中SIRT6對(duì)PGC-1α生理功能的調(diào)控作用及其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。研究已經(jīng)證實(shí)，PGC-1α在不同組織器官中具有不同的生理功能，棕色脂肪組織中，PGC-1α?xí)龠M(jìn)線粒體生物合成和適應(yīng)性產(chǎn)熱；肝臟中，PGC-1α?xí){(diào)節(jié)糖異生和脂肪酸氧化；肌肉組織中，PGC-1α則參與調(diào)控肌肉纖維類型轉(zhuǎn)化[18]。這在一定程度上暗示，SIRT6對(duì)PGC-1α的調(diào)控可能是具有組織特異性的。

SIRT1與SIRT6同屬sirtuins家族，對(duì)SIRT1的研究遠(yuǎn)早于對(duì)SIRT6的研究，隨著研究發(fā)現(xiàn)SIRT1具有廣泛而重要的生理功能， SIRT1被寄予厚望作為治療糖尿病、心血管疾病等疾病的分子靶點(diǎn)[26]。令人遺憾的是，SIRT1是一把雙刃劍，在具有積極生理學(xué)功能的同時(shí)，會(huì)因抑制細(xì)胞凋亡而增加機(jī)體罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[27]。隨著對(duì)SIRT6研究的深入，越來(lái)越多的研究表明SIRT6有望成為治療肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病的靶點(diǎn)。SIRT6不僅在調(diào)控能量代謝和糖脂代謝中發(fā)揮積極的生物學(xué)功能，同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)SIRT6可以延緩衰老，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[28-30]。后續(xù)我們將對(duì)SIRT6進(jìn)行更深入透徹的研究，驗(yàn)證其作為治療肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病分子靶點(diǎn)的可能性，以期為治療代謝性疾病提供新的可能。