微泡菌ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14的表達及信息學(xué)分析

吳利洋，梁梅芳，倪 輝,2,3,4，肖安風(fēng),2,3,4，姜澤東,2,3,4，朱艷冰,2,3,4

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；4.廈門市南方海洋研究中心經(jīng)濟海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建 廈門 361021)

0 引言

褐藻膠是一種陰離子酸性直鏈多糖，它主要來源于褐藻類植物的細胞壁，是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古羅糖醛酸(G)通過β-1,4糖苷鍵連接構(gòu)成的線性高分子聚合物[1]。褐藻膠來源廣泛，因為其具有增稠性、穩(wěn)定性、凝膠性和螯合金屬離子等特點，所以被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)療、印染和化工等領(lǐng)域[2-4]。褐藻寡糖作為褐藻膠的降解產(chǎn)物，具有多種生物活性，如抗菌、抗氧化、抗凝血、降血糖、降血脂、抗腫瘤等[5]。

褐藻膠裂解酶具有β-消除催化裂解褐藻膠糖苷鍵的能力，產(chǎn)生多種不飽和糖醛酸寡糖及不飽和糖醛酸單體[6]。褐藻膠裂解酶具有底物專一性，據(jù)此可以將該酶分為多聚β-D-1,4-甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)和多聚α-L-1,4-古羅糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11)兩大類。褐藻膠裂解酶生物來源十分廣泛，如陸生真菌、土壤細菌、病毒、海洋細菌、棘皮動物、海洋軟體動物和海藻類等[7]，其中細菌類是該酶最為廣泛的提取來源，如假交替單胞菌[8-10]、弧菌[11]、黃桿菌[12]、芽胞桿菌[13-14]、鏈霉菌[15]等。褐藻膠裂解酶被普遍認為是定向制備褐藻寡糖的有力工具，因而，不斷尋找開發(fā)新的褐藻膠裂解酶的菌種資源，進而研究褐藻膠裂解酶，對實現(xiàn)褐藻寡糖的高效應(yīng)用具有深遠的意義。

在先前的研究中，本課題組從腐爛海帶中篩選出一株褐藻膠裂解酶高產(chǎn)菌株ALW1，鑒定為微泡菌屬(Microbulbifersp.)[16]。本研究進行Microbulbifersp.ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14基因的克隆、表達及信息學(xué)分析，為該菌株褐藻膠裂解酶AlgL14的酶學(xué)性質(zhì)、酶的結(jié)構(gòu)與功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株ALW1由本實驗室篩選獲得；EscherichiacoliDH5α和E.coliBL21(DE3)菌株由本實驗室保存；pET-28α(+)載體為Novagen公司產(chǎn)品；pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、dNTPs和DNA標(biāo)準(zhǔn)均為TaKaRa公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶為Fermentas公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒購自廣州東盛生物技術(shù)有限公司；Ni-NTA瓊脂糖樹脂為GE Healthcare公司產(chǎn)品；柱式質(zhì)粒DNA提取試劑盒和柱式DNA膠回收試劑盒均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；寡核苷酸序列的合成及核酸序列的測定均委托廈門鉑瑞生物科技有限公司完成；褐藻酸鈉為國藥集團產(chǎn)品；其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 褐藻膠裂解酶AlgL14基因的克隆

根據(jù)Microbulbifersp.ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14的基因序列，合成以下引物，P1：5′-CGCGGATCCACCGAGGTTCGAGGAGCGATTG-3′(下劃線部分為BamHI酶切位點)，P2：5′-CCGCTCGAG CAAAGAGCAAGGAGATTTCGTGTCC-3′(下劃線部分為XhoI酶切位點)。將菌株ALW1的基因組DNA作為模板，用PCR技術(shù)擴增特異的基因片段，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min 預(yù)變性；94 ℃ 55 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，凝膠回收目的基因片段。將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞。細胞涂布在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)平板上(平板上預(yù)先涂布10 μL 0.5 mol/L IPTG和50 μL 20 g/L X-gal)。從平板挑選白色單菌落進行菌落PCR鑒定重組子，并經(jīng)測序鑒定重組質(zhì)粒中的插入序列。

1.3 基因及其編碼產(chǎn)物的生物學(xué)信息分析

利用NCBI的BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行蛋白質(zhì)序列的同源性搜索。利用MEGA 6.0[17]的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用ExPASy的Protparam工具進行蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預(yù)測。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用NPS服務(wù)器(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)上的GOR4法[18]進行，利用NCBI的CD Search程序[19]在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析。利用Modeller 9.15[20]進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的三維模建，采用VMD軟件顯示蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。

1.4 褐藻膠裂解酶AlgL14重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

用BamHI和XhoI對連接有褐藻膠裂解酶AlgL14基因的T載體和表達載體pET-28α(+)進行雙酶切，電泳后回收目的片段，然后用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒進行測序驗證，所構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒命名為pET-28α-algL14。

1.5 褐藻膠裂解酶AlgL14的誘導(dǎo)表達和純化

1.5.1 誘導(dǎo)表達

將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達宿主E.coliBL21(DE3)，經(jīng)菌落PCR篩選陽性克隆后，挑取陽性轉(zhuǎn)化子的單菌落，接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL卡那霉素)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)菌液按1%(V/V)比例接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL卡那霉素)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600值達到0.6～0.8，加入異丙基硫代半乳糖苷(isopropy thiogalactoside,IPTG)至終濃度為0.05 mmol/L，在12 ℃、200 r/min條件下誘導(dǎo)表達20 h。離心收集菌體，利用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的表達情況。

1.5.2 蛋白質(zhì)純化

采用Ni-NTA瓊脂糖親和層析柱進行純化。將節(jié)1.5.1收集的菌體懸浮于10 mL預(yù)冷的緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，15 mmol/L咪唑，pH=8.0)，冰浴條件下進行超聲破菌，4 ℃下15 000 r/min離心20 min，收集上清液，用0.22 μm的濾膜過濾，將濾液參照Zhu等[21]的方法進行目的蛋白的純化。取適量樣品進行SDS-PAGE電泳分析洗脫樣品的純度，利用Bradford法[22]測定蛋白質(zhì)的濃度。

1.6 褐藻膠裂解酶的活力測定

采用DNS(3，5-二硝基水楊酸)法[23]測定還原糖含量。0.9 mL的質(zhì)量分數(shù)0.3%褐藻酸鈉底物(溶于50 mmol/L磷酸鈉緩沖液中)加入0.1 mL酶液，混合物于40 ℃水浴中反應(yīng)15 min后，加入1 mL DNS試劑，并煮沸5 min顯色，然后立即冷水冷卻至室溫。反應(yīng)液定容至5 mL，在540 nm下測定吸光度值。以滅活酶液作為空白對照。在上述條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μg還原糖(以葡萄糖計)所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

2 結(jié)果

2.1 褐藻膠裂解酶AlgL14基因的克隆

以Microbulbifersp.ALW1的基因組DNA為模板，利用褐藻膠裂解酶AlgL14的特異性引物進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增產(chǎn)物為大約1 300 bp的DNA片段(見圖1)。將該基因克隆入T載體后進行測序分析，結(jié)果顯示，目的基因的大小為1 350 bp。

2.2 褐藻膠裂解酶AlgL14基因及其編碼產(chǎn)物的序列分析

Microbulbifersp.ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14基因(1 350 bp)預(yù)測編碼449個氨基酸。該蛋白質(zhì)的前33個氨基酸殘基預(yù)測為信號肽，預(yù)測的切割位點位于A33和A34之間。將該蛋白質(zhì)序列在GenBank的Reference proteins數(shù)據(jù)庫中進行同源性搜索，結(jié)果顯示，目的基因編碼的蛋白質(zhì)序列與來自Shewanellawaksmanii(WP_028774034.1)、Haliangiumochraceum(WP_045118766.1)、HaliangiumochraceumDSM 14365(ACY14264.1)、Psychromonassp.psych-6C06(WP_101106907.1)、OpitutalesbacteriumTMED158(OUW17800.1)、Alteromonadaceaebacteriu(PCK07151.1)、GammaproteobacteriabacteriumTMED134(OUV79830.1)和Zooshikellaganghwensis(WP_094785829.1)的多聚β-D-甘露糖醛酸裂解酶或褐藻膠裂解酶的序列分別具有57%、47%、47%、44%、41%、40%、40%和40%的相似性，所以預(yù)測目的基因編碼產(chǎn)物為褐藻膠裂解酶。將本研究的菌株ALW1褐藻膠裂解酶序列與其他菌株來源的褐藻膠裂解酶序列進行比對，結(jié)果如圖2所示。將本研究的菌株ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14序列與其他多糖裂解酶家族來源的褐藻膠裂解酶序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果(見圖3)顯示，該褐藻膠裂解酶與PL-14家族褐藻膠裂解酶具有較近的親緣關(guān)系，屬于PL-14家族褐藻膠裂解酶。

2.3 褐藻膠裂解酶AlgL14基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

利用ExPASy的ProtParam工具分析目的基因所編碼蛋白質(zhì)的序列，結(jié)果如下：氨基酸個數(shù)為449，理論分子質(zhì)量大小為48.8 ku；理論等電點為6.27，負電荷殘基總數(shù)為43(D+E)，正電荷殘基總數(shù)為39(R+K)；分子式為C2169H3290N584O670S18，原子總數(shù)為6 731；預(yù)測在大腸桿菌細胞內(nèi)半衰期大于10 h，不穩(wěn)定指數(shù)為25.21，該蛋白質(zhì)分類為穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為70.36，親水性平均指數(shù)(grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0.258。

2.4 褐藻膠裂解酶AlgL14的二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

預(yù)測Microbulbifersp.ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示。α-螺旋、β-折疊和不規(guī)則卷曲所占比例分別為17.37%、59.91%和22.72%。該蛋白質(zhì)包含褐藻膠裂解酶結(jié)構(gòu)域，位于245～334位氨基酸殘基，結(jié)果如圖5所示。

2.5 褐藻膠裂解酶AlgL14的三級結(jié)構(gòu)

將Microbulbifersp.ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14進行三維模建，利用Modeller 9.15多模板建模的功能，選擇多個模板預(yù)測菌株ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14的三級結(jié)構(gòu)。模板在PDB數(shù)據(jù)庫中的登錄號分別為5GMT_B、3GNE_B和2ZZJ_A。由圖6可以看出，Microbulbifersp.ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14富含β-折疊，整體結(jié)構(gòu)由多個反向平行的β-折疊組成，呈β-果凍卷狀。AlgL14結(jié)構(gòu)中存在一個寬度較大的裂隙(圖6箭頭所示)。

2.6 褐藻膠裂解酶AlgL14的表達與純化

將重組褐藻膠裂解酶表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達宿主E.coliBL21(DE3)，進行IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示，pET-28α(+)表達質(zhì)粒插入目的基因，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，與pET-28α(+)的空載(圖7的道1)和未誘導(dǎo)的pET-28α-algL14陽性菌(圖7的道2)相比較，被誘導(dǎo)表達的含有pET-28α-algL14的陽性菌在45 ku左右有明顯的融合蛋白表達條帶(圖7的道3)。破碎菌體后，上清液用Ni-NTA agarose親和柱純化，得到重組蛋白(圖7的道4)，分子質(zhì)量為48.8 ku。

2.7 重組褐藻膠裂解酶的活力測定結(jié)果

DNS法檢測還原糖含量，進而對純化的褐藻膠裂解酶AlgL14的酶活力進行測定，結(jié)果顯示，重組褐藻膠裂解酶AlgL14的酶活力為1.14 U/mg。

3 討論

使用褐藻膠裂解酶可以制備具有多種生物活性的寡糖。此外，褐藻膠裂解酶在醫(yī)藥、海藻工程、褐藻膠的代謝研究等方面具有極其重要的作用。本研究中，從Microbulbifersp.ALW1的基因組中成功擴增了1 350 bp的褐藻膠裂解酶基因片段，該基因編碼的蛋白質(zhì)與其他菌株來源的褐藻膠裂解酶具有中等程度的相似性。將含有褐藻膠裂解酶基因的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達宿主E.coliBL21(DE3)，在37 ℃條件下利用0.5 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)表達時，目的蛋白在細胞內(nèi)主要以包涵體形式存在，利用親和層析純化不到可溶性重組蛋白(結(jié)果未示)。本研究中，在12 ℃條件下利用0.05 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)表達時，獲得了低濃度的重組蛋白，酶的活力分析顯示，目的蛋白具有褐藻膠裂解酶的活力。

褐藻膠裂解酶是多糖裂解酶家族(PLs,EC 4.2.2.-)的成員，根據(jù)酶的初級結(jié)構(gòu)可將PLs分為22個家族，褐藻膠裂解酶屬于7個家族，分別為PL-5，PL-6，PL-7，PL-14，PL-15，PL-17和PL-18，大多數(shù)細菌來源的內(nèi)切褐藻膠裂解酶屬于PL-5和PL-7，而前者多具有降解多聚β-D-甘露糖醛酸底物的特異性，后者多具有降解多聚α-L-古羅糖醛酸底物的特異性[23]。系統(tǒng)發(fā)育進化分析顯示，Microbulbifersp.ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14歸屬于PL-14家族多糖裂解酶。本研究中，Microbulbifersp.ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14的空間結(jié)構(gòu)主要為β-折疊，類似的結(jié)構(gòu)常見于葡萄糖淀粉酶和纖維素酶。AlgL14結(jié)構(gòu)中存在一個較大的裂隙，預(yù)測該結(jié)構(gòu)能使得褐藻膠底物分子容易滲透進入，并與酶催化位點相互作用。

Microbulbifersp.ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14的克隆與表達為該酶的進一步研究以及工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。在未來的研究中，可以進行Microbulbifersp.ALW1褐藻膠裂解酶AlgL14的酶學(xué)性質(zhì)以及酶的結(jié)構(gòu)與功能研究。