豆粕酶解及其品質(zhì)改善研究

陳 思，張雪芳，肖 瓊,2,3，陳艷紅,2,3，倪 輝,2,4，肖安風(fēng),2,3,4,

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；3.廈門市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021；4.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021)

0 引言

豆粕是大豆提取豆油后的殘?jiān)俳?jīng)過(guò)適度加工得到的副產(chǎn)品[1]，是目前飼料行業(yè)中使用范圍較廣的一種優(yōu)質(zhì)植物性蛋白飼料源[2]。豆粕蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在40%以上，但是分子質(zhì)量大、結(jié)構(gòu)緊密，導(dǎo)致消化利用率不高[3]。在適宜的條件下添加蛋白酶制劑，將大分子蛋白質(zhì)降解成小分子蛋白質(zhì)、小肽和氨基酸，從而使蛋白質(zhì)分子質(zhì)量降低[4]，具有低抗原性，更易于吸收，可大大提高蛋白質(zhì)的利用率[5]。李樹(shù)品等[6]選用中性蛋白酶酶解豆粕，蛋白質(zhì)消化率可達(dá)70%以上，并適當(dāng)添加纖維素酶和α-淀粉酶后，對(duì)提高蛋白質(zhì)消化率有利。李磊等[7]對(duì)大豆餅粕進(jìn)行中性蛋白酶和酸性蛋白酶雙酶聯(lián)合水解處理，探索出了最適工藝條件：先加中性蛋白酶，溫度為40 ℃，pH=8.0，料水比(m/V)為1∶9，加酶量為7%，水解6 h，后加酸性蛋白酶，溫度為45 ℃，pH=3.0，加酶量為3%，水解8 h，蛋白質(zhì)水解度可達(dá)42.2%。

蛋白酶系對(duì)非淀粉多糖如纖維素、棉籽糖、水蘇糖等不起作用，而此成分在豆粕中占較大比例(約20%)，在動(dòng)物消化道內(nèi)結(jié)合大量水，阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用[8]。所以，必須添加適宜的酶制劑降解這些抗?fàn)I養(yǎng)因子，降低對(duì)動(dòng)物消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的傷害[9]。何中山[10]研究得出：應(yīng)用中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶和β-甘露聚糖酶酶解豆粕，酶解后產(chǎn)品中還原糖為8.2%，蛋白質(zhì)水解度為4.5%。為了解決豆粕中所含的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量較大、動(dòng)物對(duì)其利用率相對(duì)較低、一些抗?fàn)I養(yǎng)因子限制了豆粕的使用[11]等問(wèn)題，本文采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探究蛋白酶和非淀粉多糖(non-starch polysaccharide,NSP)酶復(fù)合添加、反應(yīng)時(shí)間對(duì)豆粕中蛋白質(zhì)水解度、還原糖釋放量、總糖含量的影響，對(duì)酶解豆粕品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而提高其利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纖維素酶和木聚糖酶均購(gòu)自和氏璧生物技術(shù)有限公司；豆粕購(gòu)自廈門夏商淘化大同食品有限公司，質(zhì)量符合GB/T 19541—2004規(guī)定：顆粒40目，色澤呈淺黃色，具有烤大豆香味，沒(méi)有酸敗、霉變、焦化等異味，均勻流動(dòng)性好，呈不規(guī)則碎片狀，不含過(guò)量雜質(zhì)，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.2%。

甲醛、濃硫酸、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、無(wú)水亞硫酸鈉均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯酚、3，5-二硝基水楊酸、鄰苯二甲酸氫鉀均為分析純，購(gòu)自西隴化工股份有限公司。

1.2 豆粕酶解工藝

1.2.1 酶添加量對(duì)豆粕品質(zhì)的影響

將20 g豆粕裝于250 mL三角瓶中密封，121 ℃、高壓滅菌20 min，冷卻后加入中性蛋白酶，設(shè)定料水比(m/V)為1∶1，溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為48 h，研究不同加酶量對(duì)豆粕品質(zhì)的影響；添加30 U/g中性蛋白酶和不同用量的酸性蛋白酶，研究其對(duì)豆粕品質(zhì)的影響；添加30 U/g中性蛋白酶、50 U/g酸性蛋白酶和不同用量的纖維素酶，研究其對(duì)豆粕品質(zhì)的影響；添加30 U/g中性蛋白酶、50 U/g酸性蛋白酶、50 U/g纖維素酶和不同用量的木聚糖酶，研究其對(duì)豆粕品質(zhì)的影響。

1.2.2 酶解時(shí)間對(duì)豆粕品質(zhì)的影響

添加30 U/g的中性蛋白酶到裝有20 g豆粕的250 mL三角瓶中，料水比(m/V)為1∶1，攪拌均勻，置于45 ℃恒溫?fù)u床中，研究酶解時(shí)間(12,24，36，48，60，72 h)對(duì)豆粕的影響；固定以上酶解條件，添加30 U/g的中性蛋白酶和50 U/g的酸性蛋白酶，研究2種酶共同作用時(shí)不同酶解時(shí)間對(duì)豆粕品質(zhì)的影響；添加30 U/g的中性蛋白酶、50 U/g的酸性蛋白酶和50 U/g的纖維素酶，研究3種酶共同作用時(shí)不同酶解時(shí)間對(duì)豆粕品質(zhì)的影響；添加30 U/g的中性蛋白酶、50 U/g的酸性蛋白酶、50 U/g的纖維素酶和50 U/g的木聚糖酶，研究4種酶共同作用時(shí)不同酶解時(shí)間對(duì)豆粕品質(zhì)的影響。

1.3 主要檢測(cè)指標(biāo)和分析方法

1.3.1 感官評(píng)價(jià)

參照國(guó)標(biāo)GB 21172—2007[12]和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT 2218—2012[13]的規(guī)定以及陳萱等[14]使用的感官分析方法并有所改進(jìn)。設(shè)定在光線正常及無(wú)異味的環(huán)境下，將適量各種酶解豆粕樣品倒入干凈的玻璃容器中，通過(guò)目測(cè)、鼻嗅、手感分別評(píng)定樣品的顏色、氣味和質(zhì)地，具體標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 酶解豆粕感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表Tab.1 Sensory evaluation of soybean meal enzymolysis

1.3.2 pH值的測(cè)定

取各個(gè)酶解豆粕樣品l.0 g，加蒸餾水50 mL，于搖床上180 r/min振蕩20 min，過(guò)濾，測(cè)上清液pH值。

1.3.3 蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定

蛋白質(zhì)水解度測(cè)定采用甲醛滴定法[15-16]：稱取5 g樣品，加入50 mL煮沸冷卻的蒸餾水，磁力攪拌30 min，調(diào)整pH值為8.2，量取20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%中性甲醛溶液加入到水解液中，持續(xù)攪拌，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，當(dāng)pH=9.2時(shí)記錄消耗的堿液體積。蛋白質(zhì)水解度(degree of hydrolysis,DH)計(jì)算公式為：DH/%=(c×V×1.400 8)/(m×7.8)×100，式中：DH為蛋白質(zhì)水解度(%)；c為NaOH溶液濃度(mol/L)；V為NaOH溶液消耗體積(mL)；1.400 8為1 mL 0.1 mol/L NaOH相當(dāng)?shù)牡?；m為樣品的質(zhì)量(g)；7.8為每克原料蛋白質(zhì)肽鍵的物質(zhì)的量(mmol)。

1.3.4 還原糖含量的測(cè)定

還原糖含量測(cè)定采用DNS法[17]：稱取0.1 g樣品，加入30 mL蒸餾水，用磁力攪拌器攪拌溶解20 min后3 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL加DNS溶液混勻后于沸水浴顯色5 min，冷卻后加蒸餾水補(bǔ)足體積至10 mL，再次混合均勻后于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)吸光度值。每組做3個(gè)平行，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中還原糖含量。

總糖含量采用硫酸-苯酚法測(cè)定[18]：取1 g樣品加入15 mL纖維素酶液(pH=5.5)，60 ℃下振蕩水浴1 h，離心、過(guò)濾，取上清液適當(dāng)稀釋后，取2 mL稀釋液與1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%苯酚混勻，快速加入濃硫酸5 mL，混勻，室溫條件下靜置30 min，每組做3個(gè)平行，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中總糖含量?？偺堑寐?%=(X×D/m)×100，式中：X為樣品溶液的葡萄糖質(zhì)量(μg)；D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；m為樣品的質(zhì)量(μg)。水解度/%=還原糖釋放量/總糖含量×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝對(duì)豆粕品質(zhì)的影響

2.1.1 中性蛋白酶添加量對(duì)豆粕品質(zhì)的影響

參考李樹(shù)品等[6]用中性蛋白酶水解豆粕，在料水比為1∶10、pH=7.5、溫度為40 ℃條件下水解64～72 h，得到的蛋白質(zhì)消化率≥70%。采用中性蛋白酶水解豆粕，在料水比為1∶1、溫度為45 ℃條件下水解48 h，考察其添加量對(duì)豆粕品質(zhì)的影響。結(jié)果(見(jiàn)圖1)表明，加酶量達(dá)到30 U/g后，感官品質(zhì)不再變化；加酶量對(duì)pH值無(wú)明顯影響；30 U/g時(shí)蛋白質(zhì)水解度最高可達(dá)20.7%；總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著酶量增加而上升，70 U/g時(shí)最高為8.5%，還原糖的釋放量和水解度變化不明顯,說(shuō)明中性蛋白酶對(duì)還原糖分解作用不大。綜上，將中性蛋白酶的添加量確定為30 U/g。

2.1.2 酸性蛋白酶添加量對(duì)豆粕品質(zhì)的影響

參考李磊等[7]在pH=8.0、料液比為1∶9、溫度為40 ℃的條件下加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%中性蛋白酶作用6 h，后調(diào)pH=3.0，45 ℃下加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%酸性蛋白酶作用8 h，蛋白質(zhì)水解度達(dá)到了44.2%，以料水比為1∶1，溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為48 h，添加30 U/g中性蛋白酶和不同用量的酸性蛋白酶，確定適宜添加量。由圖2可見(jiàn)，加入酸性蛋白酶后，豆粕氣味由單一的醬香味轉(zhuǎn)變?yōu)闈夂竦拇枷阄?；pH值都接近于8.4，與單酶水解時(shí)比較，pH值上升，但是酸性蛋白酶適宜的pH值范圍為2.5～6.0，可能發(fā)揮不出酸性蛋白酶的優(yōu)勢(shì)；酸性蛋白酶添加量30 U/g以上，蛋白質(zhì)水解度20%左右，與單酶蛋白質(zhì)水解度相比沒(méi)有提升；總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯提高， 50 U/g時(shí)為最小值也達(dá)到了18.2%；但還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化幅度較小，僅提高了0.3%，說(shuō)明非淀粉多糖需要加入特定的酶(NSP酶)才能水解。綜上，確定酸性蛋白酶的添加量為50 U/g。

2.1.3 纖維素酶添加量對(duì)豆粕品質(zhì)的影響

考慮到蛋白酶系對(duì)非淀粉多糖不起作用，而此成分又在豆粕中占較大比例(約20%)，在動(dòng)物消化道內(nèi)可結(jié)合大量水，阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用，所以必須添加適宜的酶制劑分解[8]。其中豆皮主要是粗纖維，細(xì)胞壁中也含有纖維素，故NSP酶可選纖維素酶。高紅巖等[19]利用纖維素酶制劑降解豆粕中的纖維素，以提高豆粕蛋白質(zhì)水溶出率，加入蛋白酶和纖維素酶后蛋白質(zhì)水溶出率達(dá)到76.2%，比僅以蛋白酶水解豆粕的蛋白質(zhì)水溶出率(67.8%)高，說(shuō)明通過(guò)降解纖維素可提高豆粕蛋白質(zhì)的溶出率。

添加中性蛋白酶和酸性蛋白酶后考察纖維素酶添加量對(duì)豆粕品質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3表明，主要感官指標(biāo)維持在穩(wěn)定狀態(tài)，關(guān)鍵指標(biāo)蛋白質(zhì)水解度在50 U/g時(shí)達(dá)到最大值22.3%，還原糖釋放量明顯增加，最大值達(dá)到了2.3%，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍保持在20%以上，還原糖水解度整體提高到了10%以上，說(shuō)明纖維素酶對(duì)非淀粉多糖分解有一定作用。綜上，選擇50 U/g的纖維素酶做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 木聚糖酶添加量對(duì)豆粕品質(zhì)的影響

非淀粉多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，一種酶只能特異降解一種糖苷鍵[20]，因此考慮再加入木聚糖酶形成復(fù)合酶共同作用降解豆粕中NSP。圖4表明：主要感官指標(biāo)維持在穩(wěn)定狀態(tài)，但是蛋白質(zhì)水解度變化不大，添加復(fù)合NSP酶沒(méi)有起到強(qiáng)化蛋白質(zhì)酶解效果。究其原因可能有3點(diǎn)：一是蛋白酶的水解環(huán)境導(dǎo)致NSP酶失活，在添加有蛋白酶的前提下，NSP酶同樣作為蛋白質(zhì)極有可能作為底物而被降解；二是酶來(lái)源不同，其最佳酶活性的溫度和pH值等條件也不同，因而在同一水解條件下應(yīng)用的效果就不同，且一般NSP酶比較適合酸性環(huán)境，因此，在偏堿性環(huán)境下其酶活就可能受到抑制，達(dá)不到酶解的合適條件；三是隨著蛋白酶水平的增加，可作用的底物濃度降低，水解度的差異變小?？偺琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯下降，最小值為11.7%，降低了近10%，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與添加三酶時(shí)沒(méi)有太大區(qū)別，可能是總糖被分解時(shí)還產(chǎn)生了其他非還原糖類物質(zhì)。

2.2 酶制劑動(dòng)態(tài)酶解過(guò)程的優(yōu)化

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)豆粕感官的影響

由圖5可以看出，酶解時(shí)間對(duì)豆粕的顏色、氣味和質(zhì)地等感官指標(biāo)均有影響。在36 h之內(nèi)，時(shí)間越長(zhǎng)指標(biāo)變化越明顯，48 h后變化趨勢(shì)趨于平緩，說(shuō)明，在48 h各酶制劑組合酶解豆粕可達(dá)到較佳的效果。由圖5還可見(jiàn)，同一時(shí)間段內(nèi)，酶制劑種類的增加并沒(méi)有達(dá)到感官優(yōu)化的效果。在酶解時(shí)間較長(zhǎng)后(48～72 h)豆粕為褐色，具有濃郁的香味和粘手的觸感。

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)豆粕pH值的影響

由圖6可知，在短時(shí)間內(nèi)(12 h)酶解豆粕pH值接近于中性或偏酸性，傾向于原料pH值，這可能是該時(shí)間段為初期，酶與物料的接觸不夠充分，酶解效率低導(dǎo)致pH值的變化較小。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值隨之增大，在后期穩(wěn)定在7.8～8.2。pH值偏中性，說(shuō)明酶解作用增強(qiáng)且中性蛋白酶的影響最大。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)豆粕蛋白質(zhì)水解度的影響

蛋白質(zhì)通過(guò)水解作用水解為二肽或三肽的產(chǎn)物，具有特殊的生理活性[21-23]，在動(dòng)物體內(nèi)要比自由氨基酸和沒(méi)有水解的蛋白質(zhì)更易于吸收[24]，所以蛋白質(zhì)水解度是衡量蛋白質(zhì)酶解效率的重要指標(biāo)。由圖7可知，不同組合的酶制劑在一定的水解時(shí)間內(nèi)，均可以提高豆粕的蛋白質(zhì)水解度，且隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而提高。當(dāng)達(dá)到60 h后，水解度變化趨于平緩。僅添加中性蛋白酶，36 h后蛋白質(zhì)水解增長(zhǎng)幅度減小，72 h測(cè)得最大水解度值為22.5%；加入酸性蛋白酶后，水解度在實(shí)驗(yàn)前期得到很大提升，48～72 h后水解程度趨于穩(wěn)定且達(dá)到最大值23.8%，優(yōu)于中性蛋白酶單酶水解度，說(shuō)明兩種酶復(fù)合作用可以提高蛋白的水解度；但同時(shí)加入NSP酶如纖維素酶或和木聚糖酶后，酶解樣品與中性蛋白酶單獨(dú)酶解的對(duì)照樣品相比，水解度并沒(méi)有得到提高，說(shuō)明NSP酶并沒(méi)有起到強(qiáng)化酶解蛋白質(zhì)的作用?？紤]到蛋白質(zhì)的水解效果和時(shí)間效益，將酶解時(shí)間均定為48 h。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)豆粕糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

酶制劑酶解時(shí)間對(duì)豆粕還原糖、總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、還原糖水解度的影響見(jiàn)圖8。由圖8可見(jiàn)，同一時(shí)間段還原糖水解度大小并未同外源酶種類的增加而呈現(xiàn)規(guī)律性的變化。添加中性蛋白酶、酸性蛋白酶所得還原糖水解度較低，但與單酶相比較，其總糖含量提升。添加三酶或四酶時(shí)的總糖和還原糖含量均提高。

綜上，考慮酶解時(shí)間對(duì)豆粕各方面品質(zhì)的影響，將酶解時(shí)間確定為48 h。

3 結(jié)論

本文采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究酶用量及酶解時(shí)間對(duì)豆粕品質(zhì)的影響，表明：中性蛋白酶酶解豆粕最佳用量及時(shí)間為30 U/g，48 h，該條件下獲得蛋白質(zhì)水解度為20.1%，還原糖釋放量和總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.18%，7.44%；雙酶聯(lián)合酶解豆粕優(yōu)化酸性蛋白酶的添加量及酶解時(shí)間為50 U/g，48 h，測(cè)得豆粕蛋白質(zhì)水解度、還原糖釋放量和總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為22.7%，1.23%，18.01%；三酶復(fù)合酶解時(shí)優(yōu)化纖維素酶的加酶量及酶解時(shí)間為50 U/g，48 h，此時(shí)豆粕蛋白質(zhì)水解度、總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為18.3%，18.22%，還原糖釋放量增加，提高了1%；多酶復(fù)合酶解木聚糖酶的適宜添加量及反應(yīng)時(shí)間分別是50 U/g，48 h，蛋白質(zhì)水解度、還原糖釋放量和總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為18.3%，1.91%，15.41%。說(shuō)明，在自然pH值的條件下進(jìn)行酶解，僅添加中性蛋白酶和酸性蛋白酶復(fù)合酶解的蛋白水解度比較好，同時(shí)添加NPS酶對(duì)水解度影響不大，但是還原糖釋放量比較高。