小兒急性淋巴細(xì)胞白血病亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性及甲氨蝶呤血藥濃度監(jiān)測的意義

陳麗萍，吳云波，劉 靜

急性淋巴細(xì)胞白血病 （acute lymphoblastic leukemia，ALL）在兒童白血病中最為常見，而甲氨蝶 呤 （Methotrexate，MTX） 用 于 臨 床 治 療 兒 童ALL，是緩解后治療的關(guān)鍵藥物之一。目前的研究證實(shí)，全身應(yīng)用常規(guī)劑量的MTX不易透過血腦、血睪屏障，腦脊液中MTX的濃度很低。而增加MTX的劑量可以明顯提高血液和腦脊液的藥物濃度［1］。但隨之會帶來一些不良反應(yīng)，包括口腔潰瘍、胃腸道黏膜損害、白細(xì)胞不同程度下降及肝腎功能不全等。筆者對41例ALL患者大劑量甲氨蝶呤（highdose methotrexate，HDMTX）化療時亞甲基四氫葉酸還 原 酶 （methylene tetrahy drofolate reductase，MTHFR）基因多態(tài)性以及血藥濃度監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并觀察其在應(yīng)用HDMTX后的不良反應(yīng)，為MTX個體化用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月—2016年1月某院血液科收治的ALL小兒患者41例，男26例，女15例；年齡1～12歲，平均6.3歲。其中41例患者經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)與免疫組化檢驗(yàn)并符合臨床急性淋巴細(xì)胞白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)，且處于緩解期。

1.2 研究方法

1.2.1 甲氨蝶呤治療方法 41例患者均予以VDLP方案誘導(dǎo)緩解治療，以CAM方案［環(huán)磷酰胺（CTX）、阿糖胞苷（Ara－C）、6－巰基嘌呤（6－MP）］鞏固治療，達(dá)到完全緩解后，經(jīng)檢測血象指標(biāo)達(dá)到：粒細(xì)胞＞1.5×109/L，白細(xì)胞≥3×109/L，血紅蛋白＞90 g/L，血小板＞100×109/L，同時肝腎功能指標(biāo)均正常。此時開始采用大劑量 MTX＋亞葉酸鈣 （calciumfoli－nate，CF）方案進(jìn)行髓外白血病的預(yù)防性治療基因型為CC的ALL患者，使用MTX 3 g/m2；基因型為CT和TT的ALL患者，增加四氫葉酸鈣解救次數(shù)。其治療方案如下：（1）給予緩解期每療程MTX總量的1/6（每次不超過500 mg）作為突擊量，30 min內(nèi)快速靜脈滴入；余 5/6量，于23.5 h內(nèi)勻速持續(xù)靜脈滴入。（2）停止滴注MTX 12 h后用亞葉酸鈣解救，15 mg/m2·次，6 h/次，共 6～8次。 （3）患者化療期間合并用藥：給予磷酸肌酸鈉保護(hù)心肌功能；多烯磷脂酰膽堿促進(jìn)受損的肝功能和酶活力恢復(fù)正常，調(diào)節(jié)肝臟的能量平衡，促進(jìn)肝組織再生；鹽酸托烷司瓊阻斷嘔吐反射過程中神經(jīng)介質(zhì)的化學(xué)傳遞，治療對化療及放療引起的嘔吐。

1.2.2 甲氨蝶呤基因檢測 開始采用大劑量MTX沖擊治療前抽取患者靜脈血2 ml，EDTA抗凝，使用基因組DNA抽提試劑盒 （北京天根公司）提取DNA。 MTHFR（677C＞T）多態(tài)位點(diǎn)采用凱杰公司的焦磷酸檢測技術(shù)進(jìn)行檢測。使用北京博邁德公司的PCR試劑配擴(kuò)增反應(yīng)液，引物由凱杰公司提供的軟件進(jìn)行設(shè)計，再由上海生工合成。PCR條件：95℃3 min，（95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）×45 個循環(huán)。PCR完成后用焦磷酸測序儀（PyroMark Q96 ID）進(jìn)行測序分型。

1.2.3 甲氨蝶呤血藥濃度監(jiān)測 大劑量MTX開始滴注后48 h、72 h采對側(cè)上肢靜脈血2 ml，應(yīng)用TDX熒光偏振免疫分析儀（FPIA，美國雅培公司）檢測MTX血藥濃度。MTX試劑由雅培公司提供。直至血藥濃度達(dá)0.1μmol/L以下時停止監(jiān)測和解救。

1.2.4 觀察指標(biāo) 觀察所有患者不同基因多態(tài)性以及MTX血藥濃度水平，其發(fā)生不良反應(yīng)包括骨髓抑制、肝腎損害、皮膚損害、惡心嘔吐等的比例，比較其差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，MTHFR基因型與不良反應(yīng)關(guān)系的分析采用頻數(shù)分布，組間比較采用 χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者接受MTX藥物相關(guān)基因檢測制定個體化治療方案前后不良反應(yīng)比較 41例ALL患者未經(jīng)過藥物相關(guān)基因檢測前，常規(guī)用藥出現(xiàn)骨髓抑制3例次，消化道癥狀6例次，肝功能損害3例次，口腔黏膜損害9例次，惡心嘔吐6例次，發(fā)生不良反應(yīng)16例，不良反應(yīng)發(fā)生率為39.0%。根據(jù)藥物相關(guān)基因檢測結(jié)果進(jìn)行個體化增加亞葉酸鈣解救頻次，患者出現(xiàn)骨髓抑制1例次，肝功能損害1例次，消化道癥狀3例次，口腔黏膜損害4例次，惡心嘔吐6例次。有患者11例發(fā)生不良反應(yīng)，不良反應(yīng)發(fā)生率為 26.8%。

基因檢測測定調(diào)整個體化用藥前后比較，χ2=9.409，P=0.002，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 該項(xiàng)研究結(jié)果顯示，使用大劑量MTX時，不良反應(yīng)的發(fā)生率分別為 CC 占 35.7%，CT 占 45%，TT 占 85.7%，即基因型為CT和TT的ALL患者對藥物敏感性增加，耐受性降低，發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險較CC型的高。由此可見，適當(dāng)降低MTX的用量或增加解救藥物（亞葉酸鈣）的使用劑量，可減少不良反應(yīng)。見表1。

表1 MTHFR基因型與不良反應(yīng)的關(guān)系

2.2 患者血藥濃度監(jiān)測情況及個體化用藥前后不良反應(yīng)比較 目前，公認(rèn)的MTX中毒血藥濃度為：給藥后 24 h＞10 μmoL/L，48 h＞1 μmoL/L，72 h＞0.1 μmoL/L，若在給藥 48 h 后血藥濃度＞0.25 μmoL/L，則應(yīng)加大解救劑量，增加解救次數(shù)，使72 h后血藥濃度低于 0.1 μmoL/L［2］。該研究中，治療組患者采用大劑量MTX治療，藥物基因檢測前，患者48 h血漿 MTX 濃度＞1μmoL/L者 4例，占 9.8%；患者經(jīng)藥物基因檢測并增加亞葉酸鈣解救劑量及頻次，48 h后血漿 MTX 濃度＞1μmoL/L者 1例，僅占 2.4%；患者給藥后72 h血藥濃度均低于0.1μmoL/L。

3 討論

ALL是臨床常見惡性血液系統(tǒng)疾病，多見于小兒，起病隱匿、進(jìn)展迅速。甲氨蝶呤是用于兒童急性淋巴細(xì)胞白血病治療的常用藥物，大劑量沖擊療法的廣泛應(yīng)用，明顯降低髓外白血病的發(fā)生，提高了患者的長期生存率。但值得注意的是由于患者的基因多態(tài)性造成不同個體對MTX的敏感性及耐受性有很大差異。MTX是一種葉酸還原酶抑制劑，5，10－MTHFR是葉酸－甲硫氨酸代謝的關(guān)鍵酶，其導(dǎo)致DNA的生物合成受到抑制，治療中常常發(fā)生各種不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為黏膜損害、肝功能異常及骨髓抑制等［3］。其基因中677位核苷酸由胞嘧啶（C）突變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），使得酶的活性降低，改變細(xì)胞內(nèi)活性葉酸成分的分布［4］，可能使機(jī)體對MTX的敏感性增強(qiáng)，增加ALL患者對MTX的不良反應(yīng)［5］。許宏等［6］報道的MTX在MTHFR 677CT基因型體內(nèi)代謝緩慢，24 h MTX血藥濃度較高，這很好地解釋了MTHFR的基因多態(tài)性與MTX治療時不良反應(yīng)之間的關(guān)系。即MTHF R677C＞T可以增加MTX治療的不良反應(yīng)的發(fā)生率。研究表明，ALL與MTHFR基因型突變相關(guān)［7］。變異基因攜帶者對甲氨蝶呤更為敏感，對藥物不良反應(yīng)的耐受性降低，在使用大劑量藥物時，這種情況可能會更為明顯，可產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)。臨床藥師將臨床藥學(xué)和藥物基因組學(xué)結(jié)合，從基因組水平上深入認(rèn)識疾病及藥物作用的個體差異的機(jī)制。對急性淋巴細(xì)胞白血病患者HDMTX化療期間，根據(jù)檢測MTHFR基因型進(jìn)行個體化治療，患者藥物基因檢測前，患者48 h血漿MTX濃度＜0.25 μmoL/L 者 37 例，占 90.2%；血漿 MTX 濃度＞1μmoL/L者 4例，占 9.8%；不良反應(yīng)發(fā)生率為39.0%，經(jīng)過藥物相關(guān)基因檢測后，增加亞葉酸鈣解救次數(shù)，患者48 h血漿MTX濃度＜0.25μmoL/L者40例，占97.6%；血漿 MTX濃度＞1μmoL/L者1例，占2.4%；出現(xiàn)不良反應(yīng)發(fā)生率為26.8%?；驒z測測定調(diào)整用藥前后比較，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。有效地減少患者嚴(yán)重的不良反應(yīng)的發(fā)生。

綜上所述，大劑量MTX治療兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者通過對MTHFR的基因檢測，了解患者對MTX毒性風(fēng)險的高低，對風(fēng)險較高，則需實(shí)施個體化給藥，嚴(yán)格治療規(guī)范，提早預(yù)防其不良反應(yīng)的發(fā)生。出現(xiàn)不良反應(yīng)時，及時采取相應(yīng)措施，積極處理。同時血漿MTX濃度監(jiān)測下，用亞葉酸鈣補(bǔ)救，為臨床與患者建立新型的臨床藥學(xué)模式。