醬油選育菌種制曲條件的優(yōu)化研究

萬萍，周琳，孫杰，吳枚枚，段獻(xiàn)銀，劉達(dá)玉

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，成都 610106)

醬油作為中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，歷史悠久，兼具色、香、味，并且營養(yǎng)豐富，是中國百姓生活中不可缺少的調(diào)味品之一。經(jīng)過幾千年的改進(jìn)與創(chuàng)新，我國醬油生產(chǎn)已經(jīng)有了很大的發(fā)展，整個(gè)釀造工藝也不斷趨于完善。然而，目前我國醬油釀造業(yè)與日本相比仍具有較大差距。我國醬油生產(chǎn)仍然面臨產(chǎn)品質(zhì)量不高、成曲質(zhì)量不良、原料轉(zhuǎn)化率低、發(fā)酵周期長等問題。這些問題的存在，嚴(yán)重制約了我國醬油行業(yè)的發(fā)展和國際競爭力的提升。優(yōu)良菌種及其優(yōu)質(zhì)成曲是提高醬油質(zhì)量的關(guān)鍵。影響制曲的因素主要有生產(chǎn)菌種、原料選擇、水源質(zhì)量、浸泡時(shí)間、蒸煮時(shí)間、焙炒條件、溫度情況、濕度情況、通風(fēng)情況、翻曲情況、制曲時(shí)間等[1-4]。本文采用選育性能良好的醬油專用菌種，首先分析制曲過程中影響成曲品質(zhì)的因素，在分析各制曲影響因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化醬油制曲工藝及其主要參數(shù)，以期提高種曲質(zhì)量，尤其是提高蛋白酶、糖化酶的活力，進(jìn)而提高蛋白原料的利用率。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

四川大豆、標(biāo)準(zhǔn)面粉、麩皮:由自貢天味食品有限公司與富順美樂食品有限公司提供；米曲霉A3-U12:通過改良雙層酪蛋白培養(yǎng)基進(jìn)行選擇，分離出優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，再進(jìn)行紫外誘變篩選獲得[5]；酪蛋白：購于廣州喬宣化工有限公司；酪氨酸：購于浙江綠州生物技術(shù)有限公司；福林酚試劑：購于廣州翔博生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

ZHJH-2112B生物潔凈工作臺(tái)、V63旋渦振蕩器、LRH-250生化培養(yǎng)箱、721型分光光度計(jì)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

1.3.1.1 種曲培養(yǎng)基

種曲培養(yǎng)基的配制：麩皮∶豆粉∶面粉為80∶15∶5，自來水100 mL，pH自然，潤水20 min，于121 ℃濕熱滅菌30 min。

1.3.1.2 成曲培養(yǎng)基

大豆∶面粉為90∶10，pH自然。大豆的處理方法：大豆挑選后，在40 ℃溫水中浸泡3 h，瀝干，然后于121 ℃濕熱滅菌30 min；面粉的處理方法：將面粉焙炒至金黃色，不能焦糊；制備成曲培養(yǎng)基：將大豆在不銹鋼盆里攤冷，待熱氣接近消失時(shí)，均勻拌入焙炒好的面粉即可[6]。

1.3.2 制曲工藝流程

制曲工藝流程見圖1。

圖1 制曲工藝流程Fig.1 Process flow of soy sauce koji making

1.4 理化指標(biāo)的測定方法

蛋白酶活力的測定：福林法[7]；糖化酶活力的測定：斐林法[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

本試驗(yàn)采用L9(34)設(shè)計(jì)，不考慮因素間的交互作用，留一項(xiàng)空白列作為誤差項(xiàng)，分別在3 h，30 min和36 h兩邊選取其他水平，每個(gè)水平做3個(gè)重復(fù)，主要以蛋白酶活力作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，輔以糖化酶活力來進(jìn)行綜合評判，分析不同因素對制曲的影響程度，確定制曲的優(yōu)勢工藝組合。

表1 試驗(yàn)方案及其結(jié)果Table 1 Scheme and results of experiment

2.1.2 正交試驗(yàn)的直觀分析

表2 蛋白酶活力的直觀分析表Table 2 Visual analysis of protease activity

表3 糖化酶活力的直觀分析表Table 3 Visual analysis of glucoamylase activity

由直觀分析表2和表3中的極差大小順序可知，影響成曲中蛋白酶活力的因素主次為A>B>C，最佳方案為A2B2C3，即浸豆時(shí)間3 h,蒸料時(shí)間30 min，制曲時(shí)間40 h；影響成曲中糖化酶活力的因素主次為B>A>C，最佳方案為A2B2C2，即浸豆時(shí)間3 h,蒸料時(shí)間30 min，制曲時(shí)間36 h。這2種酶活力的最佳方案不同的原因是由于蛋白酶和糖化酶在當(dāng)前環(huán)境條件下的生成速率和穩(wěn)定性不同。

圖2 酶活力直觀趨勢圖Fig.2 Trend chart of protease activity and glucoamylase activity

由圖2可知，蛋白酶活力和糖化酶活力在浸豆時(shí)間3 h和蒸煮時(shí)間30 min時(shí)產(chǎn)酶活力較高，其中浸豆時(shí)間的趨勢圖拐點(diǎn)說明浸豆3 h對產(chǎn)酶最有利，蒸煮時(shí)間在20～30 min內(nèi)對酶活的影響趨勢比較平緩，說明此時(shí)間段內(nèi)的大豆蛋白變性速度減緩，30 min后明顯呈下降趨勢，說明30 min后大豆蛋白很快就過度變性了；而隨制曲時(shí)間的延長，酶活力變化趨勢相對較平穩(wěn)。2種酶的趨勢圖有所不同，特別是制曲時(shí)間的趨勢圖，可以初步判斷2種酶達(dá)到最大酶活力的時(shí)間不同。由蛋白酶活力和糖化酶活力的分析結(jié)果可知，其各自對酶活力的影響程度與直觀分析中極差大小順序是一致的，為了制得高蛋白酶活力和酶系豐富的成曲，在不考慮交互作用的情況下，綜合上述結(jié)果，確定最優(yōu)方案為A2B2C3，即浸豆時(shí)間3 h，蒸煮時(shí)間30 min，制曲時(shí)間40 h。但由于制曲時(shí)間對2種酶活力的影響不顯著，且正交結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)2種酶活力不在同一時(shí)間達(dá)到峰值，在36～42 h之間的變化趨勢還不明朗，有必要通過驗(yàn)證試驗(yàn)來確定最終優(yōu)方案。

2.2 優(yōu)化方案驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選取制曲時(shí)間36，37，38，39，40，41，42 h，在浸豆時(shí)間3 h和蒸煮時(shí)間30 min的條件下制曲，測定蛋白酶和糖化酶活力在此時(shí)間段內(nèi)的酶活力變化情況，確定最終優(yōu)方案。

圖3 酶活力隨制曲時(shí)間的變化趨勢Fig.3 Trend of enzymatic activity with changes of koji-making time

由圖3可知，糖化酶活力在38 h時(shí)達(dá)到峰值936.73 U/g干曲，與正交試驗(yàn)確定的最優(yōu)方案推遲了2 h，從其直觀分析表中可以看到，制曲時(shí)間中的k2和k3相差很小，在36～40 h內(nèi)可能出現(xiàn)其最大酶活力峰值；而蛋白酶活力在40 h時(shí)達(dá)到峰值1435.52 U/g干曲，與正交試驗(yàn)的結(jié)果吻合。由糖化酶活力的變化趨勢可以看到，糖化酶活力在此時(shí)間段內(nèi)還是比較穩(wěn)定的，而且蛋白酶和糖化酶活力都高于其他試驗(yàn)值，因此在“以蛋白酶為主，兼顧糖化酶”的原則下，可以確定制曲條件的最優(yōu)方案為A2B2C3，即浸豆時(shí)間3 h，蒸煮時(shí)間30 min，制曲時(shí)間40 h。

3 結(jié)論

醬油制曲影響蛋白酶活力的因素主次順序?yàn)榻箷r(shí)間>蒸煮時(shí)間>制曲時(shí)間，其中浸豆時(shí)間和蒸煮時(shí)間對蛋白酶活力有顯著影響，較優(yōu)水平為浸豆時(shí)間3 h、蒸煮時(shí)間30 min、制曲時(shí)間40 h；同時(shí)也得出了糖化酶活力的因素主次順序?yàn)檎糁髸r(shí)間>浸豆時(shí)間>制曲時(shí)間，其中蒸煮時(shí)間和浸豆時(shí)間對糖化酶活力有顯著影響，較優(yōu)水平為浸豆時(shí)間3 h、蒸煮時(shí)間30 min、制曲時(shí)間36 h。在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，較優(yōu)方案的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明,在浸豆時(shí)間3 h和蒸煮時(shí)間30 min的條件下，蛋白酶活力在40 h時(shí)達(dá)到了最大值1435.52 U/g干曲，糖化酶活力在38 h時(shí)達(dá)到了最大值936.73 U/g干曲。因此，在“以蛋白酶為主，兼顧糖化酶”的原則下，最終確定制曲的最佳工藝條件為浸豆時(shí)間3 h，蒸煮時(shí)間30 min，制曲時(shí)間40 h。