Wistar大鼠腎結(jié)石形成過程的動(dòng)態(tài)觀察研究

錢成，王勤章，褚浩，徐浩，郝志強(qiáng)，錢彪

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病之一，發(fā)病率高達(dá)5%～15%［1］，多發(fā)于腎臟，最常見結(jié)石類型為草酸鈣結(jié)石［2］。腎結(jié)石患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較高且結(jié)石的形成原因難以明確，因此，研究結(jié)石形成機(jī)制是治療腎結(jié)石的重要突破點(diǎn)。研究結(jié)石形成機(jī)制的基礎(chǔ)在于腎結(jié)石動(dòng)物疾病模型的建立，建模不但可以深入了解結(jié)石的形成過程和機(jī)制及結(jié)石成因的代謝問題，而且還可以幫助篩選抗結(jié)石的中西藥物。因此，設(shè)計(jì)和建立與人類腎結(jié)石類似的動(dòng)物模型，對于探討腎結(jié)石的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和延緩結(jié)石形成、尋找防治腎結(jié)石的藥物等方面均有重要的意義。目前研究大多以乙二醇（EG）法建立大鼠腎結(jié)石模型后一次性處死取石［3］，而動(dòng)態(tài)觀察腎結(jié)石形成過程的研究相對較少。因此，本文采用EG加氯化銨誘石劑建立Wistar大鼠腎結(jié)石模型，分時(shí)段處死大鼠并對大鼠腎結(jié)石形成過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，為腎結(jié)石病因?qū)W等方面的研究提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2016年3月選取6周齡左右SPF級雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔合格證號SCXK（新）2013-0001〕。SPF級雄性Wistar大鼠均先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白對照組（NC組，n=30）和EG組（n=30）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 基本飼料（石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）、電子天平（LT1000B，常熟市天量儀器有限責(zé)任公司）、全自動(dòng)生化分析儀（Modual DPP，德國羅氏）、多功能光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（BX40，日本Olympus）、紅外光譜自動(dòng)分析儀〔LIIR-20，藍(lán)莫德（天津）科學(xué)儀器有限公司〕、透射電鏡〔JEOL-1230 Electronics，日本電子株式會社（JEOL）〕、微計(jì)算機(jī)斷層掃描技儀（Micro-CT，skyscan1176，比利時(shí)Antwerpen）。

1.3 方法

1.3.1 傳統(tǒng)EG、氯化銨溶液配制 EG溶液配制：用100 ml量筒量取10 ml EG（分析純），加自來水定容至1 000 ml，配得1%EG溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。氯化銨溶液配制：用電子天平稱取2 g氯化銨晶體（分析純），同時(shí)用量筒量取1 000 ml無菌雙濾水，將兩者充分混勻后配得2%氯化銨溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.3.2 建立動(dòng)物模型 NC組大鼠正常飲水，2 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃2周；EG組大鼠飲用1% EG溶液，2 ml 2%氯化銨溶液灌胃2周。繼續(xù)飼養(yǎng)8周，NC組大鼠正常飲水，EG組大鼠飲用1% EG溶液，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，均不限制飲用自來水。

1.3.3 一般情況觀察 連續(xù)10周觀察各組大鼠飲食飲水情況、行為活動(dòng)等，并測量其體質(zhì)量（g）。

1.3.4 標(biāo)本采集 兩組大鼠自第1周造模開始，每周處死3只。大鼠處死前1 d用代謝籠收集大鼠24 h尿液。將大鼠用10%水合氯醛以4 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，待大鼠肌肉松弛后腹部正中切口，打開腹部暴露腎臟及下腔靜脈，抽取靜脈血3～4 ml行血生化檢測。切取大鼠雙側(cè)腎組織，沖洗后稱重，快速冰凍保存，供HE染色用，并計(jì)算腎體比，腎體比=腎臟重量/體質(zhì)量×100%。采用粗針頭挑取腎臟冠狀剖面附近組織約0.5 g，烘干后供結(jié)石分析用。

1.3.5 檢測指標(biāo) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血肌酐、血尿酸、尿素氮、尿鈣、血鈣、血磷、血鎂、尿pH值、尿比重。采用解剖顯微鏡進(jìn)行結(jié)石晶體形成觀察，肉眼觀察腎臟的顏色、形狀及大小。將冰凍后腎臟標(biāo)本快速包埋，制成5 μm厚的橫斷切片，將切片固定于載玻片上，常規(guī)HE染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)晶的形成情況及腎臟病理變化情況，按文獻(xiàn)［4］提供的腎臟結(jié)晶分級判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用紅外光譜自動(dòng)分析儀進(jìn)行結(jié)石成分的分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（x ±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；等級資料比較采用秩和檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠一般情況觀察 觀察期間EG組大鼠墊料有血尿，造模期間于第8周死亡1只，第9周死亡1只。造模1～2周時(shí)兩組大鼠進(jìn)食良好、安靜溫順。造模3～8周時(shí)，NC組大鼠無特殊表現(xiàn)，EG組大鼠表現(xiàn)為煩躁興奮、活潑好動(dòng)。造模9～10周EG組大鼠表現(xiàn)為精神疲倦，針刺反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)度減少，食量減少；NC組大鼠無特殊表現(xiàn)。

2.2 大鼠血、尿生化指標(biāo)比較 EG組大鼠第2～10周血肌酐、血尿酸均高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1周血肌酐、血尿酸比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。EG組大鼠第3～8周尿素氮高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1、2、9、10周尿素氮比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。EG組大鼠第2周、第4～10周尿鈣高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1、3周尿鈣比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。EG組大鼠第5～10周血鈣高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1～4周血鈣比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。EG組大鼠第6～10周血磷、血鎂高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1～5周血磷、血鎂比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。EG組大鼠第2～8周尿pH值低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1、9、10周尿pH值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組大鼠第1～10周尿比重、尿量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。EG組大鼠第3～10周腎體比高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1～2周腎體比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

2.3 肉眼及解剖顯微鏡觀察 造模第1～2周，肉眼觀察兩組大鼠腎臟無明顯差異。造模第3周開始，肉眼觀察EG組大鼠部分腎臟較NC組略有增大，腎皮質(zhì)剖面呈紅褐色，髓質(zhì)呈橘黃色，皮髓結(jié)構(gòu)清晰，腎盞及腎盂良好。造模第6周以后，肉眼觀察EG組大鼠腎臟腫大，顏色變淺或發(fā)白，剖面呈淡黃色，皮髓結(jié)構(gòu)不清晰，可見淡黃色顆粒沉積在皮髓交界處，觸之有沙粒樣感覺；解剖顯微鏡下可見晶體以腎盂為中心呈扇形分布。造模第6周以后，肉眼觀察NC組大鼠腎臟表面光滑，腎皮質(zhì)剖面為暗紅色，髓質(zhì)呈灰白色，腎門處可見腎乳頭、腎盞、腎盂等正常結(jié)構(gòu)，未見明顯斑點(diǎn)顆粒；解剖顯微鏡下亦未見明顯結(jié)晶（見圖1）。

表 1 不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠血、尿生化指標(biāo)變化（x±s）Table 1 Changes in blood，urine biochemical indices of rats in the two groups at different time points

（續(xù)表1）

2.4 腎臟結(jié)晶及結(jié)石情況

2.4.1 兩組大鼠腎臟結(jié)晶分級形成情況及比較 整個(gè)研究期間，NC組大鼠腎臟組織未見結(jié)晶，EG組大鼠造模第3周起腎臟切片可見明亮晶體，主要分布于遠(yuǎn)曲小管、近曲小管及部分腎小球周圍，形態(tài)不規(guī)則，晶體多呈零星散在分布，少量晶體呈互相連接成片或成堆。EG組大鼠腎臟結(jié)晶分級高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.4.2 兩組大鼠腎臟病理變化情況 光學(xué)顯微鏡下觀察：造模期間NC組大鼠腎臟組織內(nèi)未見結(jié)晶沉積，無病理學(xué)改變。造模第2周起EG組部分大鼠腎臟組織內(nèi)可見腎小管上皮細(xì)胞脫落或腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤以及數(shù)量不等透明晶體，多數(shù)晶體以不規(guī)則碎片出現(xiàn)在腎小管中，部分見于集合管、間質(zhì)及被膜下，并伴有部分腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞空泡樣變性及小管上皮腫脹；造模第5～10周大鼠腎臟組織結(jié)晶量大，細(xì)胞排列紊亂，腎小管多畸形，腎小管管腔擴(kuò)大或因上皮細(xì)胞腫脹而變窄，擴(kuò)大腔內(nèi)多有壞死脫落樣物，腎小球形狀多不規(guī)則甚至壞死（見圖2）。

表 2 兩組大鼠腎臟結(jié)晶分級比較（只）Table 2 Grading of crystallization in the two groups

圖1 兩組大鼠腎臟的剖面圖Figure 1 Cross section of kidneys in the two groups of rats

圖2 兩組大鼠腎臟的冰凍切片（HE染色，×200）Figure 2 Frozen sections of kidneys in the two groups of rats

2.5 兩組大鼠結(jié)石成分分析及結(jié)石檢出率比較 NC組大鼠腎結(jié)石成分：草酸鈣結(jié)石1例（6.6%），磷酸鎂銨結(jié)石1例（3.3%），結(jié)石檢出率為6.7%（2/30）。EG組大鼠腎結(jié)石成分：草酸鈣結(jié)石7例（23.3%），草酸鈣+磷酸鈣結(jié)石5例（16.7%），草酸鈣+磷酸鎂銨結(jié)石3例（9.9%），磷酸鎂銨結(jié)石1例（3.3%），磷酸鈣結(jié)石3例（9.9%），結(jié)石檢出率為63.3%（19/30）。EG組大鼠結(jié)石檢出率高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.172，P＜0.001）。

3 討論

腎結(jié)石是一種全球性常見病和多發(fā)病，其患病率為5%～15%；腎結(jié)石成分中約80%為鈣結(jié)石，其中以草酸鈣結(jié)石最常見［5］。大鼠腎臟草酸鈣結(jié)石模型的成功建立是研究腎結(jié)石形成機(jī)制的基礎(chǔ)。目前有關(guān)草酸鈣結(jié)石的形成機(jī)制研究雖尚未達(dá)成一致性結(jié)論，很多因素均可以導(dǎo)致腎結(jié)石的形成，例如低尿量、高尿鈣、尿草酸、尿pH值，其中草酸是結(jié)石形成的重要因素。本研究造模用到的EG是目前大鼠草酸鈣結(jié)石模型造模的基礎(chǔ)促石劑，其是草酸的前體，進(jìn)入體內(nèi)后轉(zhuǎn)化為羥乙酸，其在羥乙酸氧化酶的作用下可直接變?yōu)椴菟幔部赏ㄟ^乳酸脫氫酶的作用轉(zhuǎn)化為乙醛酸，然后再轉(zhuǎn)化為草酸［6］。氯化銨可以酸化尿液，長期服用可造成腎小管功能障礙，有利于草酸鈣晶體形成，而氯化銨是一種刺激性物質(zhì)，大鼠難飲用，故配成2%氯化銨溶液灌胃2周。目前，雖然通過EG加氯化銨法建立大鼠草酸鈣結(jié)石模型已成熟，但是大多數(shù)是在建立模型之后一次性處死取石［3］，對于大鼠草酸鈣結(jié)石成石過程中的動(dòng)態(tài)變化方面的研究較少，因此本研究采用EG加氯化銨法建造Wistar大鼠腎結(jié)石模型，連續(xù)觀察10周，分期處死，動(dòng)態(tài)觀察整個(gè)結(jié)石形成過程。

本研究結(jié)果顯示，造模過程中EG組大鼠墊料有血尿，造模期間有2只大鼠死亡，此結(jié)果可能與EG及氯化銨的腎毒性有關(guān)。造模早期兩組大鼠無特殊變化；造模第3～8周時(shí)，NC組無特殊表現(xiàn)，EG組大鼠較NC組大鼠更煩躁，活動(dòng)增加。造模第9～10周時(shí)，EG組大鼠較NC組大鼠精神疲倦，活動(dòng)度減少，食量減少；NC組大鼠無特殊表現(xiàn)，此表現(xiàn)可能與EG及氯化銨造成腎損傷至晚期大鼠腎衰竭有關(guān)。肉眼觀察EG組大鼠腎組織結(jié)晶明顯，而NC組無明顯變化。在腎臟結(jié)晶分析及結(jié)石形成上，NC組大鼠無結(jié)晶形成；EG組大鼠結(jié)石檢出率較NC組大鼠高，此結(jié)果與其他研究結(jié)果相符［3］。本研究結(jié)果顯示，EG組大鼠第2～10周血肌酐、血尿酸高于NC組，第3～8周尿素氮高于NC組，第2周、第4～10周尿鈣高于NC組；此結(jié)果說明EG組在造模早期即出現(xiàn)腎功能損傷，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的高草酸及氯化銨等可以傷及腎小管上皮，引起炎性反應(yīng)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞的脫落，使基底膜暴露相符［7］。本研究結(jié)果顯示，EG組大鼠第5～10周血鈣高于NC組；EG組大鼠第6～10周血磷、血鎂高于NC組；EG組大鼠第2～8周尿pH值低于NC組；表明EG加氯化銨造模法對腎臟損傷較重，對腎功能影響程度較大。EG組大鼠第3～10周腎體比高于NC組，表明造模對腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)改變較明顯。

本研究結(jié)果顯示，腎臟病理切片中EG組大鼠腎臟內(nèi)可見鈣鹽結(jié)晶沉積，主要分布于腎小管，NC組大鼠腎組織未見晶體。EG組大鼠腎小管內(nèi)鈣鹽晶體沉積較多，伴有部分腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性及腎小管上皮腫脹，偶可見腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤或腎小管上皮脫落；NC組腎臟組織未見病理改變。此結(jié)果與傳統(tǒng)EG加氯化銨造模機(jī)制相符［8］。

腎小管細(xì)胞損傷學(xué)說是腎結(jié)石發(fā)病機(jī)制的主要學(xué)說之一。VERVAET等［9-10］研究證實(shí)，在結(jié)石形成的起始階段出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞的受損，流經(jīng)腎小管的原尿結(jié)晶鹽容易黏附于受損的腎小管上皮細(xì)胞，繼而聚集形成更大的結(jié)晶或結(jié)石。同時(shí)細(xì)胞損傷之后形態(tài)亦發(fā)生改變，其緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞，磷脂雙分子層不再對稱，膜的極性消失，細(xì)胞的防御機(jī)制被破壞［11］，以致腎結(jié)晶的黏附及進(jìn)一步形成結(jié)石，結(jié)石形成可能持續(xù)壓迫腎臟引起機(jī)械性的損傷及腎臟的缺血缺氧，腎臟損傷風(fēng)險(xiǎn)增加［12］。KHAN等［13］研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性高草酸尿會導(dǎo)致上皮細(xì)胞出現(xiàn)一系列形態(tài)學(xué)改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死并脫落，基底膜暴露，有利于結(jié)石的附著。同時(shí)，細(xì)胞受損后產(chǎn)生的碎片有助于結(jié)晶的核化和生長。在建造腎結(jié)石模型時(shí)添加可致腎小管上皮細(xì)胞損傷的藥物，可增強(qiáng)成石作用，縮短造模時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)使用到的EG可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成草酸，而高草酸尿可致腎小管壞死［14］，聯(lián)合氯化銨對腎小管上皮細(xì)胞造成損傷，使結(jié)晶更容易聚集形成結(jié)石。

雖然本實(shí)驗(yàn)對大鼠腎結(jié)石成石過程進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察，但未從細(xì)胞層面上對成石過程中大鼠腎臟損傷進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，此處還有待后續(xù)深入研究。

綜上所述，采用EG加氯化銨法建立的腎結(jié)石模型大鼠在造模第3周開始形成結(jié)石，腎結(jié)石模型大鼠明顯較空白對照大鼠精神疲倦，活動(dòng)度及飲食量減少，血、尿生化指標(biāo)明顯改變，腎體比明顯升高。本研究通過分析大鼠腎結(jié)石模型血尿生化、病理切片及結(jié)晶分級對模型動(dòng)物腎結(jié)石發(fā)展的各個(gè)階段有了較為清楚的了解，在10周時(shí)間內(nèi)完整復(fù)制了大鼠草酸鈣結(jié)石模型，明確了各個(gè)時(shí)間段的結(jié)石形成情況，較好地再現(xiàn)了腎結(jié)石發(fā)展的過程，并對其動(dòng)態(tài)觀察，為腎結(jié)石發(fā)生的機(jī)制及預(yù)防治療、結(jié)石形成過程中各個(gè)階段腎臟的變化提供了理想的動(dòng)物模型及相關(guān)數(shù)據(jù)。