穩(wěn)定表達hOAT1的HEK293細(xì)胞系的建立及鑒定

李 靜，楊 洋，肖 濤，李 韜，歐 瑜，傅曉鐘，劉 亭

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1. 貴州省藥物制劑重點實驗室/藥用植物功效與利用國家重點實驗室、2.藥學(xué)院、3. 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004；4. 貴陽市婦幼保健院藥劑科，貴州 貴陽 550002)

人有機陰離子轉(zhuǎn)運體1(human organic anion transporter 1, hOAT1)(SLC22A6)屬于可溶性載體家族SLC22。hOAT1于1997年在大鼠、小鼠和冬季牙鲆體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，并在爪蟾卵母細(xì)胞中表達后，介導(dǎo)對氨基馬尿酸(p-aminohippuric acid，PAH)、環(huán)狀核苷酸和其他小有機陰離子的攝取，表明其具有廣泛的底物特異性[1]，其 cDNA的CDS區(qū)編碼556個氨基酸殘基，有12個跨膜區(qū)域。hOAT1 在腎近端小管基底外側(cè)膜高表達，腦、胎盤亦有微弱的表達。該轉(zhuǎn)運蛋白的底物非常廣泛，包括內(nèi)源性和外源性物質(zhì)[2]。內(nèi)源性底物包括葉酸、前列腺素、環(huán)核苷酸等，外源性底物包括抗生素(先鋒霉素II、青霉素)、多種抗病毒藥物(阿德福韋酯、西多福韋、阿昔洛韋)、多種利尿劑(利尿磺胺、布美他尼)，以及非甾體類抗炎藥、甲氨蝶呤、赫曲霉素A等。同時，研究表明，核苷(核酸)類抗病毒藥物進入體內(nèi)后，代謝形成的磷酸(膦酸)雙負(fù)離子能被存在于腎小管基底膜上的hOAT1跨膜轉(zhuǎn)運而沉積于腎臟近曲小管內(nèi)，后者通過抑制近曲小管上皮細(xì)胞線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的復(fù)制，從而使mtDNA耗碣，并最終降低由mtDNA編碼的細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase, COX)水平。破壞上皮細(xì)胞氧化呼吸過程是藥物產(chǎn)生腎毒性的根本原因[3-4]。

為獲得穩(wěn)定表達hOAT1的細(xì)胞模型，用于對抗病毒核苷(核酸)類藥物的腎毒性機制進行評價，本實驗擬構(gòu)建穩(wěn)定高表達 hOAT1的細(xì)胞模型，不僅為抗病毒核苷與核酸類藥物引起的臨床劑量依賴性腎毒性的機制研究奠定模型基礎(chǔ)，也為體外研究 hOAT1 底物或抑制劑的篩選提供一個便利的工具。

1 材料

1.1試劑質(zhì)粒hOAT1 DNA購于北京博邁德基因技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS，批號1227694)、DMEM高糖培養(yǎng)基(批號8117288)，均購于Gibco公司；TOP10感受態(tài)大腸桿菌、真核表達載體pEGFP-N1和HEK293細(xì)胞株由本實驗室保存；丙磺舒(批號R09O8X45213)、兔抗β-actin單抗(批號20170310)、G418(批號712O031)、質(zhì)粒提取試劑盒(批號10217KA1)、ECL發(fā)光液(批號20170215)，均購于索萊寶公司；對氨基馬尿酸(批號wkq17041705)購于四川省維克奇生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ(批號00324407)、NheI(批號00307817)購于Thermo公司；FuGENE? 6 Transfection Reagent(批號0000285054)購于Promega公司； TRIzol? Reagent(批號152104)購于Ambion公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit(批號AK5402)、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(批號AK7802)、TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購于TaKaRa公司；鼠抗EGFP單克隆抗體(批號GR191827-3)、兔抗hOAT1多克隆抗體(批號GR176005-10)購于美國Abcam公司。

1.2儀器超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)；熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)；Modle 680酶標(biāo)儀、Allegra 64R冷凍高速離心機(美國Beckman公司)；Acugity-TQD型UPLC-MS/MS (Waters公司)；垂直電泳槽、PowerPac Basic電泳儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1真核表達載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EcoRΙ與NheI將hOAT1基因片段與pEGFP-N1載體分別雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收純化后，將酶切產(chǎn)物用T4連接酶進行連接。連接產(chǎn)物加入至TOP10感受態(tài)細(xì)胞懸液中，輕輕渦旋離心管混勻，冰浴放置30 min。置于42℃水浴1 min，然后快速置于冰浴中3 min。加入LB培養(yǎng)基，180 r·min-1、37℃培養(yǎng)1 h。

將轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物涂布于含卡拉霉素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%)的LB瓊脂平板上進行篩選培養(yǎng)，挑選單克隆，并進行擴增培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRΙ與NheI將質(zhì)粒雙酶切后，挑取陽性克隆進行測序。最終獲得重組質(zhì)粒命名為pEGFP-hOAT1。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中, 于37℃和5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%～90%匯合度, 用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞以每孔1.5×105個的密度接種于6孔板, 待細(xì)胞長至85%匯合度時，為最佳轉(zhuǎn)染狀態(tài)。將FuGENE? 6 Transfection Reagent加入到無血清培養(yǎng)基中，混合后孵育5 min，分別加入重組質(zhì)粒pEGFP-hOAT1和空白質(zhì)粒pEGFP-N1，混合后孵育15 min。分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光信號在細(xì)胞的表達與分布。

2.3篩選穩(wěn)定表達[5]pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞 配制合適比例的pEGFP-hOAT1質(zhì)粒DNA與FuGENE? 6 Transfection Reagent的轉(zhuǎn)染液，轉(zhuǎn)染液經(jīng)比例優(yōu)化，確定最佳比例為1 ∶3(μg ∶μL)，將轉(zhuǎn)染液加入至HEK293細(xì)胞中，于37℃和5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。通過熒光倒置顯微鏡觀察，將轉(zhuǎn)染效率達到95%的細(xì)胞原培養(yǎng)液更換為濃度800 mg·L-1的G418選擇性培養(yǎng)液，間隔1 d更換1次含相同濃度的G418培養(yǎng)液，進行抗性篩選14 d，挑選單克隆細(xì)胞擴大培養(yǎng)，更換維持濃度的G418培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

2.4hOAT1mRNA的表達檢測

2.4.1RT-PCR檢測hOAT1 mRNA水平 以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞為實驗組，野生型HEK293細(xì)胞為對照組，收集細(xì)胞。利用TRIzol? Reagent提取RNA，測定其濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板，利用hOAT1引物進行PCR擴增，PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火1 min，40個循環(huán)，72℃延伸10 min。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。GAPDH上游引物5′-GGTCCTGGTTCTCATTCCT-3′，下游引物5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；hOAT1上游引物5′-CTTGAAC TACCTGCAGACAG-3′，下游引物5′-GACATAGCCAATCAAGGTGC-3′，由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。

2.4.2qRT-PCR檢測hOAT1 mRNA水平 以mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，進行熒光定量PCR反應(yīng)。PCR擴增程序同“2.4.1”。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2-△△Ct方法分析數(shù)據(jù)。

2.5Westernblot檢測蛋白表達水平分別收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1、瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，及野生型HEK293細(xì)胞，PBS洗滌2次，利用膜蛋白提取試劑盒分別提取膜蛋白，用BCA法測定蛋白含量。取等量膜蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用1×TBST洗膜3次(每次5 min)。將膜在5%的BSA中封閉2 h，分別加入兔抗β-actin單抗(1 ∶1 000)、兔抗hOAT1多克隆抗體(1 ∶2 500)和鼠抗EGFP單克隆抗體(1 ∶2 500)，4℃孵育過夜，用1×TBST洗膜3次(每次5 min)。加入對應(yīng)二抗室溫孵育2 h后，用1×TBST洗膜3次(每次5 min)?，F(xiàn)配發(fā)光液，進行曝光拍照。

2.6pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系的功能鑒定

2.6.1考察PAH細(xì)胞安全濃度范圍 分別將生長至對數(shù)期的野生型HEK293細(xì)胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞用0.25%的消化后，以密度為1.5×108·L-1鋪96孔板。取100 μL細(xì)胞懸浮液于每孔，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，并設(shè)置空白對照組，即加入等體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h，分別在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞及其野生型細(xì)胞中，設(shè)置濃度為25、50、100、200、400 μmol·L-1的PAH組。孵育1 h，棄藥液，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基及5 μL MTS，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，利用酶標(biāo)儀檢測吸光度值，計算細(xì)胞存活率，考察PAH安全濃度范圍。細(xì)胞存活率=OD樣品組/OD對照組×100%。

2.6.2考察丙磺舒細(xì)胞安全濃度范圍[6]細(xì)胞分組同“2.6.1”。培養(yǎng)24 h，分別給藥在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞及其野生型細(xì)胞中，設(shè)置給藥濃度為25、50、100、200、400 μmol·L-1的丙磺舒。孵育1 h，棄藥液，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基及5 μL MTS，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，利用酶標(biāo)儀檢測吸光度值，按“2.6.1”公式計算細(xì)胞存活率，考察丙磺舒安全濃度范圍。

2.6.3野生型HEK293細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞對PAH的攝取 將野生型HEK293細(xì)胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞，以每孔3×105個細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h 后進行PAH攝取實驗。棄去舊培養(yǎng)基，用HBSS緩沖液沖洗1次，隨后加入PAH，其稀釋質(zhì)量濃度為10、25、50、100、200 μmol·L-1，空白對照孔加入等體積HBSS緩沖液，將細(xì)胞放入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h。迅速吸棄藥液，加入冰冷PBS反復(fù)洗2次。隨后使用超聲波細(xì)胞粉碎儀破碎細(xì)胞，12 000×g離心20 min。吸取上清液20 μL，BCA法測定蛋白濃度，另取500 μL上清液氮氣吹干，加入300 μL甲醇混勻，12 000×g離心20 min，沉淀蛋白，重復(fù)2次。最后取上清200 μL，UPLC-MS/MS分析受試化合物的攝取量。

2.6.4丙磺舒對野生型HEK293細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞的抑制作用 將野生型HEK293細(xì)胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞，以每孔3×105個細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后進行丙磺舒對hOAT1抑制實驗。棄去舊培養(yǎng)基，用HBSS緩沖液沖洗1次，隨后加入丙磺舒，其稀釋質(zhì)量濃度為100 μmol·L-1，空白對照孔加入等體積HBSS緩沖液，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中預(yù)孵育10 min。迅速吸棄藥液，加入PAH。細(xì)胞分組與操作同“2.6.3”。

2.7色譜與質(zhì)譜條件色譜柱 Waters Van Guard BEH C l8 (2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)柱，柱溫：45℃，流速：0.25 mL·min-1，進樣體積：2.0 μL，流動相：A：含0.1%甲酸的乙腈，B：含0.1%甲酸的水，梯度洗脫：(0～1.5 min，5% A；1.5～4 min，5%～100% A ；4～6 min，100%～ 5% A )。錐孔電壓為：45 V，質(zhì)譜采用選擇離子監(jiān)測(SIR)，正離子模式，以葛根素為內(nèi)標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1真核表達載體pEGFP-hOAT1鑒定Fig 1瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，pEGFP-hOAT1質(zhì)粒的主帶在6.4 kb左右，與理想大小相符合。EcoRΙ與BamHI雙酶切pEGFP-hOAT1質(zhì)粒的產(chǎn)物亦符合理論大小(Fig 2)。將陽性克隆測序，結(jié)果與GenBank(AB009697.1)報道的hOAT1序列相符，說明質(zhì)粒pEGFP-hOAT1構(gòu)建成功。

Fig 1 Gel electrophoresis of pEGFP-hOAT1recombinant plasmid

M: Marker; 1: pEGFP-hOAT1 recombinant plasmid.

Fig 2 Identification of the recombinant plasmiddigested by EcoR Ι and Nhe I

M: Marker; 1: pEGFP-hOAT1 recombinant plasmid.

3.2穩(wěn)定表達pEGFP-hOAT1細(xì)胞株的建立與鑒定FuGENE? 6 Transfection Reagent介導(dǎo) pEGFP-hOAT1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞36 h后，在含有G418(800 mg·L-1)的選擇培養(yǎng)基中篩選14 d，4 d后會有大量的明顯死亡(Fig 3)。獲得穩(wěn)定表達hOAT1的HEK293細(xì)胞。

Fig 3 Cell morphology(×100)

A: Culture aton the third 3rd day; B: Culture aton the fourteenth 14th day.

3.2.1綠色熒光鑒定 FuGENE? 6 Transfection Reagent介導(dǎo)pEGFP-hOAT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞36 h 后，熒光顯微鏡下觀察瞬時轉(zhuǎn)染后綠色熒光信號分布。如Fig 4所示，細(xì)胞融合至80%時，綠色熒光陽性率高達100% 。結(jié)果表明，構(gòu)建的重組質(zhì)?？捎行П磉_帶綠色熒光的pEGFP-hOAT1融合蛋白。

Fig 4 Cell morphology under fluorescence microscope(×100).

3.2.2hOAT1 mRNA在HEK293細(xì)胞中的表達 Fig 5瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在GAPDH表達量相同時，pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞可擴增出190 bp的目的片段，而HEK293細(xì)胞組擴增不出目的條帶。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組細(xì)胞中hOAT1 mRNA表達明顯升高，表達量為HEK293細(xì)胞的5 600倍，差異具有顯著性(P<0.01)。結(jié)果表明，pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞能轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA，外源基因已整合到HEK293細(xì)胞基因組。

Fig 5 Analysis of hOAT1 mRNA

3.2.3Western blot鑒定hOAT1、EGFP特異性蛋白的表達 Fig 6的Western blot結(jié)果表明，pEGFP-hOAT1融合蛋白在穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞株高表達，且分子量大小正確，與RT-PCR結(jié)果一致。說明pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系構(gòu)建成功。

Fig 6 hOAT1 and EGFP protein were analyzed

1: Stable transfected HEK293 cells; 2: HEK293 cells.

3.3pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞功能鑒定

3.3.1PAH的細(xì)胞安全濃度范圍 如Tab 1所示，PAH濃度在400 μmol·L-1以下，對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞及其野生型細(xì)胞均沒有毒性作用(P>0.05)。因此，選擇給藥時間1 h以內(nèi)、給藥濃度400 μmol·L-1以下，考察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞及其野生型細(xì)胞對PAH的攝取能力。

Tab 1 Toxic effects of PAH on cells after 1

3.3.2丙磺舒的細(xì)胞安全濃度范圍 如Tab 2所示，丙磺舒濃度在400 μmol·L-1以下對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞及其野生型細(xì)胞均沒有毒性作用(P>0.05)。因此，選擇給藥時間1 h以內(nèi)、給藥濃度400 μmol·L-1以下，考察丙磺舒對hOAT1的抑制作用。

3.3.3HEK293細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞對PAH的攝取 分別給予PAH(10、25、50、100、200 μmol·L-1)至穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞及野生型HEK293細(xì)胞中，并測定PAH的攝取量。Fig 7結(jié)果表明，與HEK293細(xì)胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞對PAH的攝取量明顯較高(P<0.01)，且在100 μmol·L-1時，pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞對PAH的攝取量趨于飽和。說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞系模型構(gòu)建成功。

Tab2Toxiceffectsofprobenecidoncells

GroupConcentration/μmol·L-1Cell activity/%HEK293 cellsStable transfected HEK293 cellsControl-100.00±8.25100.00±7.62Probene-cid25102.42±8.00103.76±1.6950 108.25±5.07105.53±1.04100 105.21±7.45107.81±7.10200 104.64±9.92101.74±4.27400107.49±6.98102.32±3.70

Fig 7 Concentration dependence of PAH uptake

**P<0.01vsHEK293 group

3.3.4丙磺舒對hOAT1的抑制作用 對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞進行預(yù)孵育，給予濃度為100 μmol·L-1的丙磺舒后，吸棄藥液，分別給予PAH(10、25、50、100、200 μmol·L-1)，測定PAH的攝取量。Fig 8結(jié)果表明，加入丙磺舒后，pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞對PAH的攝取量明顯下降(P<0.01)，丙磺舒對轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞系有明顯抑制作用。丙磺舒為hOAT1的抑制劑，說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞系模型構(gòu)建成功。

Fig 8 Probenecid suppressesd concentration

**P<0.01vsstable transfected HEK293 cells with inhibitors

4 討論

外源基因是否表達，以及目的蛋白是否具有活性，是鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是否構(gòu)建成功的重要標(biāo)志。構(gòu)建 hOAT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的意義不僅在于基因水平要有變化，蛋白水平也要有變化，本方法目的是從蛋白水平對藥物進行評價研究。本文通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞呈綠色熒光；采用PCR和Western blot技術(shù)，檢測hOAT1和EGFP在基因及蛋白水平均有表達；并且PAH攝取及進一步的丙磺舒抑制實驗證實，所表達的hOAT1目的蛋白具有活性。綜上所述，pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系構(gòu)建成功。PAH為hOAT1經(jīng)典底物，故選擇PAH對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞進行功能鑒定。為了進一步驗證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞篩選模型的可行性，給予丙磺舒對模型進行了抑制劑研究，結(jié)果表明，對轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞系有明顯抑制作用，與文獻報道一致，提示該細(xì)胞模型可用于hOAT1抑制劑的篩選。

真核表達載體pEGFP-N1中包含增強型綠色熒光蛋白基因 (enhanced green fluorescence protein，EGFP)，EGFP是水母體內(nèi)綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)的突變體[7]，該蛋白對宿主細(xì)胞沒有毒性、表達穩(wěn)定，熒光強度是GFP的6倍以上；且EGFP與蛋白偶聯(lián)后，不僅可在細(xì)胞內(nèi)觀察目的蛋白表達、分布，還不會影響外源蛋白的構(gòu)象和功能。而在目的基因hOAT1中缺少EGFP基因，本文采用將EGFP與hOAT1基因相連接，得到可表達EGFP-hOAT1的融合蛋白，使其帶有綠色熒光標(biāo)記，易于觀察。FuGENE?6 Transfection Reagent是一種新型的非脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染試劑，需要少量的外源DNA，轉(zhuǎn)染效率高，且該方法操作簡單、重復(fù)性良好，不會對靶細(xì)胞產(chǎn)生直接損傷或毒性。本文構(gòu)建EGFP-hOAT1融合蛋白，利用FuGENE?6 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察不僅可以通過熒光強弱反映目的蛋白的含量，還可以研究目的蛋白的細(xì)胞分布。且PAH的攝取實驗結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞對PAH的攝取量明顯較高，表明EGFP-hOAT1融合蛋白具有hOAT1特性介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運功能。此外，本文發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染效率與宿主細(xì)胞的狀態(tài)有較大的聯(lián)系，一般會選用50代以下的細(xì)胞，若出現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)不好，轉(zhuǎn)染效率下降，會轉(zhuǎn)用新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞，且細(xì)胞匯合度在80%時，轉(zhuǎn)染效率最佳；在12 h后就可以觀察到熒光信號，并隨著時間的增加而增強，在36 h時轉(zhuǎn)染效率最佳。

在以往的研究中，hOAT1轉(zhuǎn)染模型的構(gòu)建大多采用瞬時轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染基因?qū)爰?xì)胞得以表達，但是基因不會整合到細(xì)胞的基因組上，隨著細(xì)胞生長分裂，外源基因會逐漸消失，而大量的藥理學(xué)研究需要的周期較長。而本文提供了構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hOAT1的方法，解決了目的蛋白鑒定繁瑣、轉(zhuǎn)染方法復(fù)雜及轉(zhuǎn)染效率低等問題，所得細(xì)胞模型靈敏、穩(wěn)定、可靠。

綜上所述，穩(wěn)定表達pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞株的建立，可用于確定 hOAT1的底物和抑制劑，為進一步研究核苷類膦酸類似物類藥物引起的臨床劑量依賴性腎毒性的機制奠定模型基礎(chǔ)。