晶V型芒果苷對高尿酸血癥小鼠的作用及其機制研究

楊海光，周啟蒙，王海港，程 笑，趙曉悅，呂 揚，方蓮花，杜冠華

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所 1. 北京市藥物靶點研究與新藥篩選重點實驗室、2. 北京市晶型藥物研究重點實驗室，北京 100050)

高尿酸血癥是由于機體內(nèi)尿酸合成或排泄失衡，造成的一種代謝性疾病。《高尿酸血癥和痛風(fēng)治療的中國專家共識》指出，隨著我國人民生活水平的提高，我國高尿酸血癥逐年上升，特別是在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的城市和沿海地區(qū)，患病率達(dá)到5%～23.5%[1]。高尿酸血癥也是痛風(fēng)發(fā)病的關(guān)鍵因素[2]。目前，已上市治療高尿酸血癥的藥物主要有黃嘌呤氧化酶抑制劑、尿酸轉(zhuǎn)運體抑制劑、重組尿酸酶補充劑等幾大類，但是其不良反應(yīng)和肝腎毒性均較大。

芒果苷(mangiferin，2-β-D-吡喃葡萄糖苷-1,3,6,7-四羥基-9H-氧雜蒽酮)，又稱知母寧、芒果素，主要從漆樹科和龍膽科植物的葉、莖、果實、樹皮中提取得到，也是中藥知母的主要活性成分[3]。芒果苷作為藥用植物中提取的單一化合物，具有多種藥理學(xué)活性。近年來，已有多篇論文報道了芒果苷的降尿酸作用。本研究采用固體灌胃方式給予晶V型芒果苷后，從臟器指數(shù)、生化指標(biāo)、腎臟病理變化方面，探討其對高尿酸血癥小鼠的治療作用，從尿酸轉(zhuǎn)運體相關(guān)基因方面探討其治療作用機制。

1 材料

1.1實驗動物SPF級昆明種♂小鼠70只，體質(zhì)量(20±2)g，購自北京市華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK 2014-0004。飼養(yǎng)于12 h照明、溫度(25±2)℃環(huán)境中。

1.2試劑晶V型芒果苷(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所晶型中心提供)；氧嗪酸鉀(oteracil potassium)、別嘌呤醇(allopurinol, AP)；苯海岸馬隆(benzbromarone,BR)均購自Sigma公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、TRIzol(Thermo Fisher Scientific公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037Q)、實時熒光定量試劑盒(RR820Q)，均購自TaKaRa公司；尿酸(uric acid，UA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)測定試劑盒，高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)測定試劑盒，均購自中生北控生物科技股份有限公司；黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3儀器TBA-40全自動生化儀(日本東芝公司)；EclipseTi-U熒光顯微鏡(日本尼康公司)；小鼠固體給藥系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國家藥物篩選中心研制)[4]；實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)；微量紫外/熒光核酸測定儀(DeNovix公司)；低溫高速離心機(Beckman公司)；金屬浴(杭州奧盛儀器有限公司)；24孔樣品研磨均質(zhì)勻漿儀(OMNI公司)。

2 方法

2.1動物分組、給藥和造模將小鼠隨機分為7組：正常對照組(Control)、模型組(Model)、別嘌呤醇組(AP，25 mg·kg-1)、苯溴馬隆組(BR，25 mg·kg-1)、晶V型芒果苷低、中、高劑量組(10、30、100 mg·kg-1)，每組10只。正常對照組每天腹腔注射CMC-Na溶液，其他各組每天下午腹腔注射氧嗪酸鉀CMC-Na混懸液(300 mg·kg-1)。連續(xù)造模7 d后，d 8起每天上午灌胃給予各組相應(yīng)藥物，其中晶V型芒果苷各劑量組通過固體給藥方法灌胃，下午繼續(xù)腹腔注射氧嗪酸鉀混懸液，連續(xù)給藥14 d。在末次給予氧嗪酸鉀1 h后，每組取部分小鼠稱重后摘眼球取血，解剖取肝臟、雙側(cè)腎臟稱重，立即放入液氮中，再轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱，備用。其余小鼠4%多聚甲醛灌流，取腎，4%多聚甲醛固定，備用。

2.2臟器指數(shù)、血清生化指標(biāo)、肝臟XO活性測定臟器指數(shù)為自身組織重量與自身體質(zhì)量的比值。全血7 000 r·min-1離心10 min，分離血清，全自動生化分析儀測定UA、ALT、AST、BUN、CRE、LDL、HDL。取肝組織，加入適量預(yù)冷生理鹽水，全自動勻漿器勻漿，4 ℃、12 000 r·min-1離心40 min，重復(fù)2次，取上清，12 000 r·min-1再次離心10 min，取上清，按試劑盒說明書測定肝XO活性。

2.3腎組織蘇木精-伊紅(HE)染色組織從低到高濃度乙醇脫水，二甲苯浸泡，石蠟包埋，切片成7 μm厚的組織樣本。染色前，二甲苯脫去切片石蠟，用從高到低的濃度的乙醇浸泡，去離子水浸泡。HE染色，再脫水、透明、中性樹膠封固。顯微鏡下觀察并統(tǒng)計。

2.4RT-qPCR檢測腎、腸尿酸轉(zhuǎn)運體mRNA、肝XOmRNA的表達(dá)參考文獻(xiàn)并查詢NCBI，利用Pubmed中Pick Primer在線軟件挑選引物，并對產(chǎn)物進(jìn)行Blast，確保擴(kuò)增基因特異性(Tab 1)。取50～100 mg腎臟、肝臟、結(jié)直腸組織到研磨管中，每管加入1 mL TRIzol，并低溫研磨提取總RNA。取1 μL總RNA，測定純度和濃度?？俁NA定量2 μg加入反轉(zhuǎn)錄體系(5×Prime Script Buffer 2 μL，RrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，DEPC水定量至20 μL)，37℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85℃ 5 s。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，加入實時熒光定量體系(SYBR Premix Ex Taq II 12.5 μL，PCR上、下游引物各1 μL，無菌dH2O 8.5 μL)，95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-△△t相對定量法統(tǒng)計。

Tab 1 Primer sequence used in real time PCR analysis

3 結(jié)果

3.1晶V型芒果苷對高尿酸血癥小鼠臟器指數(shù)的影響Tab 2結(jié)果顯示，與正常組比較，陽性藥BR組小鼠肝臟指數(shù)明顯增高(P<0.01)，而晶V型芒果苷各劑量組肝臟指數(shù)正常。與正常組比較，陽性

Tab 2 Effect of mangiferin (crystalⅤ) on visceral index in hyperuricemia mice induced by potassium n=10)

##P<0.01vscontrol

藥AP和BR組腎臟指數(shù)均有所升高，提示兩種陽性藥對腎臟可能有一定的影響，而晶V型芒果苷各劑量組腎臟指數(shù)正常。晶V型芒果苷低劑量組的脾臟指數(shù)明顯增大(P<0.01)，其他各組對脾臟指數(shù)無明顯影響。

3.2晶V型芒果苷對高尿酸血癥小鼠血清生化指標(biāo)的影響Tab 3結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠血尿酸水平明顯升高(P<0.01)，而兩個陽性藥組和晶V型芒果苷中劑量組均能明顯降低UA水平(P<0.01)，晶V型芒果苷低、高劑量組也具有一定降UA趨勢。與正常組比較，模型組小鼠AST水平明顯增加(P<0.05)，陽性藥AP組和晶V型芒果苷高劑量組也明顯增高AST水平(P<0.01)。與正常組和模型組比較，陽性藥AP組能夠明顯增高BUN和CRE水平(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥BR組、晶V型芒果苷低、高劑量組均能明顯降低血清LDL(P<0.01，P<0.05)。與正常組比較，除BR組外，其他各組均能明顯降低血清HDL水平(P<0.05，P<0.01)。

3.3晶V型芒果苷對高尿酸血癥小鼠肝臟XO活性的影響如Fig 1所示，與正常組比較，模型組小鼠肝臟XO活性增高，陽性藥和晶V型芒果苷均可以降低XO水平，其中AP和晶V型芒果苷高劑量組與模型組比較，差異具有顯著性(P<0.05)。

Fig 1 Effect of mangiferin (crystalⅤ) on activity of hepatic XO in hyperuricemia mice induced by

*P<0.05vsmodel

3.4晶V型芒果苷對高尿酸血癥小鼠腎臟病理學(xué)變化的影響如Fig 2所示，與正常組相比，模型組腎小管上皮基底膜變薄，腎小管組織缺失。陽性藥別嘌呤醇組腎小球萎縮，腎小球囊壁層收縮，結(jié)構(gòu)不完整；BR組基底膜輕微變薄，近曲小管不完整。晶V型芒果苷低、中、高劑量組腎小管上皮細(xì)胞增厚，形態(tài)與正常組基本一致。

Fig2Effectofmangiferin(crystalⅤ)onhistopathologyinhyperuricemicmiceinducedbypotassiumoxonate(×100)

A: Control; B: Model; C: AP; D: BR; E: Mangiferin(Ⅴ, 10 mg·kg-1); F: Mangiferin (Ⅴ, 30 mg·kg-1); G: Mangiferin(Ⅴ, 100 mg·kg-1).3.5晶V型芒果苷對高尿酸血癥小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運體、結(jié)直腸尿酸轉(zhuǎn)運體、肝臟XOmRNA表達(dá)的影響如Fig 3所示，在小鼠腎臟尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運體1(urate anion transporter 1，URAT1)mRNA表達(dá)水平方面，陽性藥BR與晶V型芒果苷各劑量組明顯高于正常組和模型組；腎臟葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白9(glucose transporter 9，GLUT9)mRNA表達(dá)水平方面，模型組、陽性藥BR和晶V型芒果苷高劑量組表達(dá)水平上調(diào)，低、中劑量組表達(dá)低于模型組；腎臟ABC轉(zhuǎn)運蛋白2(ATP-binding cassette superfamily member 2，ABCG2)mRNA表達(dá)水平方面，模型組表達(dá)水平明顯降低，陽性藥AP、BR能明顯升高其表達(dá)，并高于正常組，而晶V型芒果苷各劑量組與模型組比較，表達(dá)水平無明顯變化；腎臟有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白1(organic anion transporter 1，OAT1)mRNA表達(dá)水平方面，模型組表達(dá)水平降低，陽性藥BR組表達(dá)水平上調(diào)，其他各組與模型組比較差異無顯著性；腎臟

Fig3Effectofmangiferin(crystalⅤ)onmRNAexpressionsof
renaluratetransporters,intestineuratetransportersandhepaticxanthineoxidaseinhyperuricemicmiceinducedby

A: GLUT9,URAT1 mRNA from kidney in mice; B: OAT1,OAT2,OAT3,NPT1,OCTN1 mRNA from kidney in mice; C: PDZK1 mRNA from kidney in mice; D: ABCG2,GLUT9 mRNA from colorectum in mice; E: XO mRNA from liver in mice.#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

OAT2、OAT3 mRNA表達(dá)水平方面，與正常組比較，其他各組表達(dá)水平均明顯降低；磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1(sodium-dependent phosphate transport protein 1，NPT1)mRNA表達(dá)水平方面，各組表達(dá)水平無顯著性差異；腎臟有機陽離子轉(zhuǎn)運體1(organic cation transporter 1，OCTN1)mRNA表達(dá)水平方面，與正常組比較，模型組有一定的上調(diào)，與模型組比較，BR和晶V型芒果苷中劑量組表達(dá)有一定的下降；腎臟轉(zhuǎn)

Tab 3 Effect of mangiferin (crystalⅤ) on biochemical indicators in serum of hyperuricemia mice induced by potassium n=10)

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

運體支架蛋白1(PDZ domain containing 1，PDZK1)mRNA表達(dá)水平方面，與正常組比較，模型組、BR和晶V型芒果苷高劑量各組表達(dá)均上升，其余各組較模型組表達(dá)下降。

在小鼠腸道ABCG2 mRNA表達(dá)水平方面，與正常組比較，其他各組表達(dá)水平均明顯下降；腸道GLUT9 mRNA表達(dá)水平方面，與正常組比較，其他各組表達(dá)水平均明顯下降，同時晶V型芒果苷中劑量組能明顯下調(diào)模型小鼠的表達(dá)水平；在小鼠肝臟XO mRNA表達(dá)水平方面，模型組表達(dá)水平明顯高于正常組，其他各給藥組均能明顯降低模型小鼠的XO mRNA的表達(dá)(Fig 3)。

4 討論

高尿酸血癥是由于機體內(nèi)尿酸合成和排泄失衡造成的代謝性疾病。尿酸的合成依靠一系列酶促反應(yīng)，其中XO是尿酸合成的關(guān)鍵酶，核酸類化合物在肝臟組織中通過XO等酶促反應(yīng)生成尿酸。根據(jù)核酸體內(nèi)外來源不同，尿酸合成分為內(nèi)源性和外源性兩個部分。尿酸的排泄大部分通過腎臟排泄(70%)，其余通過腸道(30%)。尿酸經(jīng)過腎小球濾過、腎小管重吸收及分泌，一部分排出體外，另一部分重吸收入血[5]。當(dāng)機體過多攝入核酸類物質(zhì)或者尿酸排泄障礙時，均可以引起高尿酸血癥。針對導(dǎo)致高尿酸血癥的兩種途徑，目前已上市藥物和在研藥物的作用機制可以分為兩類，抑制尿酸合成途徑相關(guān)酶和調(diào)節(jié)尿酸排泄相關(guān)蛋白。另外，還可以向人體直接注入外源重組尿酸酶，瞬時降低尿酸水平。

近年來，針對尿酸轉(zhuǎn)運蛋白的靶點研究愈發(fā)深入，它們主要分布在腎臟近曲小管上皮細(xì)胞基底外側(cè)膜、頂側(cè)膜和管腔膜。依據(jù)對尿酸轉(zhuǎn)運機制不同，主要分為3種類型蛋白：第1類尿酸重吸收蛋白，包括葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白9(GLUT9)、尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運體1(URAT1)、有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白4(OAT4)等；第2類尿酸分泌蛋白，包括機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白1(OAT1)、有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白2(OAT2)、有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白3(OAT3)、ABC轉(zhuǎn)運蛋白2(ABCG2)、磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(NPT1)、肉毒堿轉(zhuǎn)運體(OCTN1)等；第3類轉(zhuǎn)運體支架蛋白1(PDZK1)[6]。腸道中，特別是結(jié)直腸上皮細(xì)胞中，也表達(dá)尿酸轉(zhuǎn)運蛋白[7]。以上這些蛋白均參與尿酸的排泄，或輔助相關(guān)蛋白形成復(fù)合物，參與尿酸的排泄。URAT1是已上市藥物苯溴馬隆、丙磺舒、Verinurad治療高尿酸血癥的經(jīng)典靶蛋白[8-9]。

本研究觀察各組臟器指數(shù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)陽性藥AP、BR組肝臟和腎臟指數(shù)均增大，提示肝腎可能出現(xiàn)病變，這種病變與兩種陽性藥的毒性和超敏反應(yīng)有一定的相關(guān)性[10-11]。全血生化指標(biāo)顯示，腹腔給予氧嗪酸鉀后，模型組小鼠血尿酸水平明顯升高，陽性藥AP、BR及晶V型芒果苷均能明顯降低血尿酸水平，但是AP組的AST、BUN、CRE明顯升高，提示陽性藥AP具有一定的肝腎毒性，這與文獻(xiàn)報道一致，而晶V型芒果苷中劑量組未出現(xiàn)肝、腎毒性。以上結(jié)果說明，晶V型芒果苷能降低尿酸，同時肝、腎毒副作用小。

肝臟XO活性測定和基因表達(dá)檢測結(jié)果顯示，模型組肝臟XO的活性和mRNA表達(dá)均明顯升高，晶V型芒果苷各劑量組可以一定程度上降低XO活性，明顯降低XO mRNA表達(dá)。提示晶V型芒果苷能夠通過尿酸合成途徑，抑制XO的合成，從而減少體內(nèi)尿酸的生成。對小鼠腎臟、結(jié)直腸尿酸轉(zhuǎn)運蛋白的機制研究顯示，晶V型芒果苷低、中劑量組可以降低高尿酸血癥小鼠腎臟和腸道中尿酸重吸收蛋白GLUT9 mRNA的表達(dá)，提高腎臟PDZK1 mRNA的表達(dá)。但是對其他轉(zhuǎn)運蛋白無調(diào)節(jié)作用，或起到相反的調(diào)節(jié)作用。綜合尿酸轉(zhuǎn)運蛋白mRNA表達(dá)結(jié)果提示，晶V型芒果苷可能作用于GLUT9和PDZK1兩種蛋白靶點，發(fā)揮排泄途徑的降尿酸作用。這與已上市促尿酸排泄藥物作用靶點不一樣。

高尿酸血癥能夠引起急性尿酸腎病和慢性尿酸腎病。發(fā)病原理是由于高濃度尿酸導(dǎo)致尿酸結(jié)晶析出，并沉積在腎間質(zhì)中，堵塞集合管，壓迫遠(yuǎn)端腎血管，改變腎臟血流動力學(xué)變化，同時造成腎小管內(nèi)皮損傷。尿酸腎病還可繼續(xù)發(fā)展為尿酸性腎結(jié)石，甚至腎衰竭。治療高尿酸血癥腎損傷最根本的方法還是及時降低體內(nèi)尿酸濃度，同時保護(hù)內(nèi)皮，抑制炎癥因子的釋放[12]。本實驗通過HE染色方法，考察各給藥組對腎臟的影響，結(jié)果表明，晶V型芒果苷各組能夠減少空泡化程度，腎皮質(zhì)飽滿，一定程度上改善腎損傷。而陽性藥AP組出現(xiàn)更加嚴(yán)重的病理變化，這與其全血生化指標(biāo)和臟器指數(shù)顯示的肝、腎毒性現(xiàn)象一致。

本實驗選用的晶V型芒果苷為前期篩選的優(yōu)勢晶型，生物利用度高。實驗中采用固體給藥的方式，避免溶解藥物對晶型的破壞，使化合物在體內(nèi)充分發(fā)揮藥理作用。

綜上所述，晶V型芒果苷作為來源于植物提取的優(yōu)勢晶型單一化合物，可以有效降低高尿酸血癥小鼠血尿酸水平，改善高尿酸血癥造成的腎損傷，未出現(xiàn)明顯肝、腎毒性或損傷，發(fā)揮了天然產(chǎn)物低毒、有效的作用特點。機制研究表明，晶V型芒果苷通過作用于尿酸合成和排泄兩個途徑，起降尿酸作用。