羅格列酮與全反式維甲酸誘導小鼠胚胎成纖維細胞定向骨分化研究

王 涵,邵 英,朱茄慧,廖云鵬,馬 妍,任文艷, 周林云,吳 柯,何百成

(1. 重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室， 2. 重慶醫(yī)科大學藥理學教研室，重慶 400016)

羅格列酮(rosiglitazone, RSG)可作為過氧化物酶體增殖體活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)的激動劑，對2型糖尿病有明顯治療效果。但RSG長期使用后可明顯致骨質疏松，尤其是對年老女性患者[1]。據報道，RSG及其同類藥物可誘導骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells, bMSCs)向脂肪細胞分化[2]，打破骨形成與骨吸收之間的平衡，引起骨質疏松。目前，臨床上主要使用RSG與二磷酸鹽聯用治療2型糖尿病，預防由RSG所引起的骨質疏松[3]。但是，二磷酸鹽本身也存在很多嚴重不良反應，如房顫等[4]。因此，二磷酸鹽類藥物可能并非預防RSG所致骨質疏松的最佳選擇。

間充質干細胞是一種具有多向分化潛能的干細胞[5-6]，包括bMSCs以及C3H0T1/2和C2C12等。小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)也具有多向分化潛能，可定向分化為成骨或脂肪細胞等。MEFs易于獲取，且基因組未進行任何修飾，可能更適合用于干細胞定向分化研究。PPARγ是調節(jié)成脂分化關鍵的轉錄因子之一[7-8]，通過與類視黃醇X受體(retinoid X receptor，RXR)結合，調節(jié)bMSCs或其他干細胞向脂肪細胞分化。研究表明，PPARγ對干細胞向成骨細胞分化也具有促進作用[9]。因此，RSG可能對干細胞的成脂和成骨分化均具有重要作用。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A的重要代謝物之一，在胚胎和個體發(fā)育中具有重要的調節(jié)作用[10]。ATRA與維甲酸受體(retinoic acid receptor，RAR)或RXR結合，發(fā)揮對機體各種生物過程的調節(jié)作用[10-11]。研究表明，ATRA可促進骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphogenetic protein 9, BMP9)誘導前體脂肪細胞骨向分化的作用[12]。因此，RSG與ATRA合用可能對干細胞骨向分化有調節(jié)作用。本研究主要分析RSG與ATRA聯合應用能否誘導干細胞定向骨分化，及介導該過程的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與細胞株 NIH孕鼠(E12.5)購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。成肌細胞C2C12和間充質干細胞C3H10T1/2購買于美國ATCC(American Type Culture Collection)。實驗所用的細胞培養(yǎng)條件為5% CO2和37℃，采用高糖DMEM(含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、0.1 g ·L-1鏈霉素)進行培養(yǎng)。

1.1.2試劑 一抗OPN、OCN、RUNX2、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8、GAPDH、C/EBPα等，均購自Santa Cruz Biotechnology公司。ATRA由重慶華邦制藥饋贈；羅格列酮購自Sigma-Aldrich公司，二者均采用DMSO為溶媒。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司), 倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)，化學發(fā)光和熒光測定儀(美國BIOSCAN公司)，臺式低溫離心機(美國Thermo公司)，定量PCR儀(Bio-Rad公司)，垂直電泳槽、濕式轉膜儀(北京六一)。

1.2小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)的提取MEFs細胞從 NIH小鼠12.5 d的胚胎中提取獲得。將胎鼠去除內臟后，用手術刀切成小塊，用1 mL 0.25%的胰蛋白酶在37℃消化15 min， 然后加入10 mL含血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。最后，將其放入100 mm的培養(yǎng)皿中37℃培養(yǎng)24 h， 貼壁的細胞即為MEFs。

1.3RNA提取以及聚合酶鏈反應將細胞種到T25培養(yǎng)瓶中，按實驗設計用相應因素處理。采用TRIzol法提取總RNA，然后通過逆轉錄反應得到cDNA。將得到的cDNA稀釋10倍，作為定量PCR和常規(guī)PCR的模板。實驗所涉及到的引物序列詳見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences used in this investigation

1.4Westernblot實驗將細胞用0.25%的胰酶消化后接種到6孔板中，細胞貼壁后，分別加入RSG、ATRA或RSG+ATRA等處理因素。加入同體積的DMSO作為對照組，ATRA和RSG的終濃度分別是0.4 μmol·L-1和20 μmol·L-1。分別提取1、2、9、11 d的蛋白后，用10%的聚丙烯胺凝膠進行電泳，按常規(guī)Western blot實驗進行操作。 最后用凝膠成像儀進行成像。結果均重復3次。

1.5堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性檢測將細胞用0.25%的胰酶消化后接種到24孔板培養(yǎng)板中，用RSG、ATRA、RSG+ATRA分別處理MEFs細胞(同體積的DMSO作為空白對照組)，ATRA和RSG的濃度分別為0.4 μmol·L-1和20 μmol·L-1。于d 5、7按BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒說明書進行染色，檢測ALP的活性。每組實驗重復3次。

1.6茜素紅染色將細胞消化后接種到24孔細胞培養(yǎng)板，并按實驗設計加入相應處理因素。細胞培養(yǎng)21 d后進行茜素紅染色，檢測基質礦化的形成情況。步驟簡述如下： 棄去培養(yǎng)基后，PBS洗3次，加入2.5%戊二醛固定20 min，棄戊二醛后，用pH為4.2的PBS洗1次，再用茜素紅工作液孵育30 min。最后，棄染液并用水清洗即可。每組實驗重復3次。

1.7油紅O染色將細胞種于24孔培養(yǎng)板中，并加入相應處理因素，于14 d后，進行油紅O染色。棄去培養(yǎng)基后PBS洗2遍，10%甲醛固定30 min后，用PBS清洗。用新鮮配制的油紅O工作液孵育30 min，用水清洗后進行拍照。每組實驗重復3次。

1.8螢光素酶報告質粒檢測實驗將細胞消化后種到T25培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后采用Lipofectamine 2000轉染2 μg報告質粒。16 h后，將細胞重新消化并種于24孔細胞培養(yǎng)板，在細胞貼壁后加入相應因素進行處理。24 h后將細胞裂解，按試劑盒操作說明測定報告質粒轉錄活性。采用BCA法測定總蛋白濃度，用于校正螢光素酶活性。每組實驗重復3次。

2 結果

2.1PPARγ、RAR、RXR受體及其亞型在干細胞中的表達情況本研究主要目的是分析RSG誘導的干細胞成脂分化是否可以在ATRA存在的情況下向成骨分化。RSG是PPARγ的激動劑，而ATRA則是RAR和RXR的激動劑。因此，本研究首先分析這些受體在干細胞中的表達情況。Fig 1定量PCR檢測結果顯示，以上受體在C2C12、C3H10T1/2、MEFs等細胞中均有表達。結果提示， RSG和ATRA在這些干細胞中可與相應的受體相結合發(fā)揮調控功能。由于MEFs是原代細胞，其基因組未經過任何修飾，所以本研究選用MEFs進行后續(xù)實驗。

Fig 1 Endogenous expression of PPARγ , RXR and RAR in C2C12, C3H10T1/2 and MEFs

1：PPARγ；2：RXRα；3：RXRβ；4：RXRγ；5：RARα；6：RARβ；7：RARγ. Quantitative PCR analysis results showed the endogenous expression level of PPARγ and the different isoforms of RXR and RAR in the available cell lines and MEFs. The results were expressed as the ratio of mRNA expression level of each receptor to corresponding GAPDH expression

2.2RSG和ATRA對MEFs細胞ALP活性的影響本研究首先檢測RSG或ATRA在MEFs細胞中對ALP活性的影響。結果表明，ATRA濃度依懶性地明顯增強MEFs細胞中ALP活性，即使?jié)舛仍?.1 μmol·L-1時也具有促進作用(Fig 2A、2C)。RSG能增強MEFs細胞的ALP活性，但所需最低濃度明顯高于ATRA(Fig 2B、2D)。以上結果表明， RSG或ATRA都有增加MEFs細胞ALP活性的潛能。本研究進一步分析RSG和ATRA之間是否存在協同誘導MEFs細胞ALP活性的作用。結果顯示，在MEFs細胞中，RSG可促進ATRA誘導的ALP活性(Fig 2E)；同樣，ATRA也明顯促進RSG誘導的ALP活性。以上結果提示，RSG與ATRA或許可以促進MEFs細胞定向骨分化。

2.3RSG和ATRA在MEFs中對成骨指標表達和鈣鹽沉積的影響雖然RSG 與ATRA合用可增強MEFs細胞中ALP的活性，但還不足以說明兩者聯用可促進骨干細胞分化。因此，本研究繼續(xù)進行相關成骨分化實驗分析。Western blot分析結果顯示， RSG合用ATRA不僅促進OPN和OCN表達(Fig 3A)，還明顯誘導鈣鹽沉積(Fig 3B～3D)。但RSG或ATRA單獨處理MEFs細胞時，并未出現明顯鈣鹽沉積。以上實驗結果提示，RSG聯合ATRA至少在體外可誘導MEFs細胞定向骨分化。

硬件電路設計則選用TPS43000作為PWM控制器；采用同步BOOST電路為電源轉換電路。為了降低開關管的損耗，開關管的導通電阻應盡量小，NMOS 開關管選擇 Si4866DY，其RDS（ON）為 10 mΩ；PMOS開關管選擇 Si4403DY，其RDS（ON）為 17 mΩ。參數設計同仿真設計相同，如表1所示。電路原理圖如圖9所示。

2.4ATRA和RSG對MEFs成脂分化的影響以上結果證實，RSG聯合ATRA可促進MEFs骨向分化，但相關作用分子機制目前尚不明確。RSG導

Fig 2 Effects of RSG or/and ATRA on ALP activities in MEFs

A: ALP staining results showed the effect of ATRA on ALP activities in MEFs; B: ALP staining results showed the effect of RSG on ALP activities in MEFs; C: ALP activity assay results showed the effect of ATRA on ALP activities in MEFs; D: ALP activity assay results showed the effect of RSG on ALP activities in MEFs.**P<0.01vscontrol; E: ALP staining results showed the effect of RSG on ATRA-induced ALP activities in MEFs; F: ALP staining results showed the effect of ATRA on RSG-induced ALP activities in MEFs; G: ALP activities assay results showed the effect of RSG on ATRA-induced ALP activities in MEFs; H: ALP activities assay results showed the effect of ATRA on RSG-induced ALP activities in MEFs.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsRSG or ATRA treated group.

致骨質疏松的主要原因是bMSCs向脂肪細胞分化所致。因此，ATRA聯合RSG誘導MEFs骨向分化可能與干擾脂肪分化有關。油紅O染色實驗結果顯示，RSG處理組脂滴增加明顯，ATRA處理組無明顯脂滴生成，RSG合并ATRA組脂滴生成明顯減少(Fig 4A、4B)。 Western blot結果顯示，RSG 在MEFs

Fig 3 Effects of RSG and/or ATRA on different osteogenic markers in MEFs

A: Western blot assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the expression of OPN and OCN in MEFs. GAPDH was used as loading control; B: Alizarin Red S staining results showed the effect of RSG and/or ATRA on matrix mineralization in MEFs; C: Quantification results of Alizarin Red S staining showed the effect of RSG and/or ATRA on matrix mineralization in MEFs.**P<0.01vscontrol; D: Representative images for Alizarin Red S staining results showed the effect of RSG and/or ATRA on matrix mineralization in MEFs.

中明顯誘導C/EBPα表達，ATRA抑制C/EBPα表達，且明顯降低RSG誘導的C/EBPα表達(Fig 4C、4D)。 以上結果提示，RSG與ATRA合用促進MEFs骨向分化的作用可能與ATRA抑制RSG誘導成脂分化有關。

2.5RSG與ATRA對MEFs中BMP/Smad信號轉導的影響Runx2是成骨分化調節(jié)重要的早期轉錄因子之一，報告質粒檢測結果顯示，ATRA聯用RSG明顯增加Runx2熒光素酶報告質粒的轉錄活性(Fig 5A)；Western blot實驗結果也顯示，RSG與ATAR均增加Runx2表達，兩者聯合明顯增加Runx2在MEFs細胞中的蛋白水平(Fig 5B)。作為一種重要的成骨分化轉錄調節(jié)因子，Runx2受到BMP/Smad信號調節(jié)。熒光素酶報告質粒分析結果顯示，RSG對報告質料的轉錄活性無影響，ATRA可增加其轉錄活性；ATRA與RSG聯合應用時報告質粒的轉錄活性明顯增加(Fig 5C)。Western blot結果顯示，RSG可增加p-Smad1/5/8的水平，但這種作用不如ATRA明顯，兩者合用明顯增加p-Smad1/5/8的水平(Fig 5D)。PCR結果顯示，ATRA與RSG合用明顯增加Smad6的表達，但對Smad7表達有抑制作用(Fig 5E)。以上實驗結果提示，ATRA與RSG聯合應用促進MEFs骨向分化的機制可能也與增強BMP/Smad信號轉導活性有關。

3 討論

RSG及其同類藥物對2型糖尿病具有較好的治療效果，但長期使用可導致骨質疏松。本研究發(fā)現， RSG與ATRA聯用可以誘導MEFs定向骨分化。這種作用可能與RSG和ATRA聯用抑制脂肪分化，以及增加BMP/Smad的信號轉導活性有關。因此，ATRA可能對RSG及其類似藥物所導致的骨質疏松具有預防或治療作用。

Fig 4 Effects of RSG and/or ATRA on adipogenic differentiation in MEFs

A: Oil Red O staining results showed the effect of RSG and/or ATRA on the adipogenesis in MEFs; B: Quantification of Oil Red O staining results showed the effect of RSG and/or ATRA on the adipogenesis in MEFs; C: Western blot assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the expression of C/EBPα in MEFs. GAPDH was used as loading control; D: Quantification of Western blot assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the expression of C/EBPα in MEFs.#P<0.05,##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsRSG.

RSG可增加機體對胰島素的敏感性而對2型糖尿病有明顯療效。但由于RSG能促進bMSCs向脂肪細胞分化，所以長期使用可致骨質疏松，尤其是對年老的女性患者[1]。目前，臨床上常用RSG與二磷酸鹽合用治療2型糖尿病，以減輕RSG對骨代謝平衡影響。二磷酸鹽可在某種程度上預防骨密度的降低[7]，但并不能抑制RSG誘導bMSCs成脂分化；同時，二磷酸鹽本身也具有上消化道不良反應、下頜骨壞死以及房顫等不良反應[7]。因此，二磷酸鹽類藥物可能并不是預防RSG等所導致骨質疏松的最佳選擇。雖然RSG作為PPARγ激動劑可誘導干細胞向脂肪細胞分化，但當PPARγ沉默后，干細胞骨向分化的能力同樣也減弱。ATRA作為維生素A的重要代謝物之一，可與RAR或RXR結合形成異二聚體，發(fā)揮ATRA對機體生理功能的調節(jié)作用。目前，ATRA對干細胞骨向分化存有爭議：有研究認為，ATRA能抑制成骨分化且在高濃度時會誘發(fā)骨質疏松[12]；但課題組前期研究表明，ATRA能增加BMP9所誘導的干細胞成骨分化。這種不同的結果可能與ATRA的濃度(或劑量)、細胞種類以及誘導因子有關。以上研究提示，PPARγ信號可參與調節(jié)并促進干細胞骨向分化；同時，RSG與ATRA合用可能會促進干細胞骨向分化。

Fig 5 Effects of RSG and/or ATRA on expression of Runx2 and BMPs/Smads signal transduction in MEFs

A: Luciferase reporter assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the transcriptional activities of p6×OSE-Luc reporter; B: Western blot results showed the effect of RSG and/or ATRA on the expression of Runx2 in MEFs. GAPDH was used as loading control; C: BMPR Smads binding elements luciferase reporter (p12×SBE-Luc) assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the activation of BMPs/Smads signaling transduction in MEFs; D: Western blot assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the level of Smad1/5/8 and p-Smad1/5/8 in MEFs. GAPDH was used as loading control; E: PCR assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the expression of Smad6 and Smad7.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

的重要調節(jié)信號之一。分析結果顯示，RSG與ATRA合用能促進Runx2表達，促進Smad1/5/8磷酸化和增加Smad6的mRNA水平。因此，RSG與ATRA合用促進MEFs骨向分化可能與增加BMP/Smad信號轉導活性也有關。

綜上所述，本研究發(fā)現RSG與ATRA聯用可以誘導MEFs骨向分化, 機制可能與抑制脂肪分化和增加BMP/Smad信號轉導活性有關。該發(fā)現為預防RSG及其同類藥的骨質疏松不良反應提供了實驗基礎。