不同貯藏條件下大黃魚(yú)生物胺變化

朱作藝，張 玉王君虹李 雪王 偉，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 320021；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部創(chuàng)意農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

生物胺(biogenic amine，BA)是一類(lèi)具有生物活性含氮的低分子量有機(jī)化合物[1]。過(guò)量生物胺會(huì)產(chǎn)生諸多不良反應(yīng)，包括偏頭痛、惡心、血壓變化等，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致休克而危及生命[2-4]。生物胺中毒性最大的是組胺，其次是酪胺[5-6]。研究表明：口服8～40 mg組胺導(dǎo)致輕微中毒，40～100 mg引起中度中毒，超過(guò)100 mg導(dǎo)致嚴(yán)重中毒，酪胺超過(guò)100 mg會(huì)引起偏頭痛，苯乙胺超過(guò)3 mg則導(dǎo)致血壓升高。此外，生物胺容易與亞硝酸鹽反應(yīng)生成致癌性物質(zhì)亞硝胺[7]。目前已報(bào)道的生物胺產(chǎn)生途徑主要是氨基酸脫羧和醛酮類(lèi)化合物的氨基化作用[8-9]。生物胺廣泛存在于水產(chǎn)品、肉類(lèi)產(chǎn)品與發(fā)酵制品中[10-16]。歐盟、美國(guó)和我國(guó)對(duì)水產(chǎn)品中的生物胺均有相應(yīng)的限量要求。

大黃魚(yú)屬于低組胺魚(yú)類(lèi)，是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。目前，大黃魚(yú)貯藏過(guò)程中的品質(zhì)變化主要研究pH值、揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)值、菌落總數(shù)、過(guò)氧化值、K值、感官評(píng)價(jià)等指標(biāo)，針對(duì)其生物胺變化規(guī)律及與品質(zhì)之間相關(guān)性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。目前，生物胺的測(cè)定方法主要有薄層色譜法[17]、氣相色譜法[18]、離子色譜法[19]、液相色譜法[20-21]等。本研究采用離子色譜法測(cè)定生物胺，研究了不同溫度(0、4、25 ℃)和不同鹽分(0、0.5%、2.0%、5.0% NaCl)處理?xiàng)l件下大黃魚(yú)中生物胺與貯藏時(shí)間的關(guān)系，并通過(guò)分析生物胺與腐敗指標(biāo)(TVB-N值)的相關(guān)性，研究生物胺與大黃魚(yú)品質(zhì)的關(guān)系，以期為控制大黃魚(yú)生物胺生成、提高大黃魚(yú)貯藏質(zhì)量、保障其食用安全提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大黃魚(yú)購(gòu)于杭州沃爾瑪超市，產(chǎn)自福建寧德，屬養(yǎng)殖品種，已于-18 ℃條件下凍結(jié)6 d，直接從冷庫(kù)(-18 ℃)挑選個(gè)體均一(每條約400 g)、背部灰褐色、腹部金黃色的個(gè)體，冰藏條件下2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

Dionex ICS-3000離子色譜儀(Thermofisher)，配有DP雙泵(帶脫氣裝置)，DS6電導(dǎo)檢測(cè)器，Chromeleon 6.8色譜工作站(用于軟件控制及數(shù)據(jù)采集)；Ultimate 3000系列VWD-3X00 UV-VIS檢測(cè)器(Thermofisher)；AS自動(dòng)進(jìn)樣器(Thermofisher)；Dionex IonPac CG17(50 mm×4 mm)保護(hù)柱，Dionex IonPac CS17(250 mm×4 mm)分析柱；Dionex CSRS 300-4 mm電化學(xué)自再生抑制器；超純水系統(tǒng)；渦旋混勻器；離心機(jī)；0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾頭。

99%甲基磺酸(MSA)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；乙腈(色譜純)，Merck公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，所有用水均為電阻率≥18.2 MΩ·cm去離子水。

標(biāo)準(zhǔn)品：組胺(histamine，His)，酪胺(tyramine，Tyr)，腐胺(putrescine， Put)，尸胺(cadaverine，Cad)，苯乙胺(phenylethylamine，Phe)，亞精胺(spermidine，Spd)，精胺(spermine，Spe)，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 樣品制備

將大黃魚(yú)破腹，去內(nèi)臟、去頭、去鱗、去皮，清洗干凈，采用縱向剖片方式取大黃魚(yú)肉片，瀝干后裝入聚乙烯自封袋中。取部分大黃魚(yú)肉片，分成3組，分別于0、4、25 ℃下貯藏，0、4 ℃貯藏16 d，25 ℃貯藏6 d。另取部分大黃魚(yú)肉片，分成3組，根據(jù)肉片質(zhì)量稱(chēng)取一定量的NaCl(分別占肉片質(zhì)量的0.5%、2.0%、5.0%)，涂抹于肉片表面，于25 ℃貯藏6 d。

1.3 生物胺測(cè)定方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取50 mg上述7種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，搖勻后分別得到濃度為1 000 mg·L-1的各種生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液于4 ℃避光保存。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用10 mmol·L-1的MSA溶液稀釋?zhuān)渲撇煌瑵舛鹊纳锇坊旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)大黃魚(yú)樣品中生物胺進(jìn)行定量。

1.3.2 淋洗液配制

配制0.1 mol·L-1MSA溶液(用于梯度淋洗脫)：吸取6.5 mL的99% MSA，用去離子水定容至1 L，采用0.45 μm微孔水膜過(guò)濾，超聲脫氣15 min。

1.3.3 色譜條件

陽(yáng)離子交換色譜柱：Dionex Ionpac CG17保護(hù)柱(50 mm×4 mm)+Dionex Ionpac CS17分析柱(250 mm×4 mm)。流動(dòng)相：0～12 min， 10 mmol·L-1MSA；12～25 min，10～35 mmol·L-1MSA；25～30 min，10 mmol·L-1MSA。流速：1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃。自再生電化學(xué)抑制模式，抑制器設(shè)置電流103 mA。檢測(cè)方式：抑制電導(dǎo)與紫外串聯(lián)檢測(cè)；電導(dǎo)檢測(cè)池溫度：35 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm(用于檢測(cè)酪胺)；進(jìn)樣量：25 μL。外標(biāo)法峰面積定量。

1.3.4 樣品前處理

大黃魚(yú)肉片樣品在勻漿機(jī)上徹底粉碎勻漿，取5.0 g待測(cè)樣品加入50 mL的10 mmol·L-1MSA，超聲提取30 min，冷凍離心機(jī)(4 ℃，8 500g)離心10 min，取上清液5 mL，加5 mL乙腈渦旋混勻，離心后取上層液體4 mL用去離子水稀釋至10 mL，混勻后過(guò)0.22 μm濾膜，然后進(jìn)樣上機(jī)。

1.4 揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定

不同溫度、鹽分貯藏條件下大黃魚(yú)的TVB-N值參照GB/T 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的第二法——自動(dòng)凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺的色譜分離檢測(cè)

本研究建立陽(yáng)離子交換色譜分離-抑制型電導(dǎo)-紫外串聯(lián)檢測(cè)腐胺、尸胺、組胺、亞精胺、苯乙胺、精胺、酪胺7種生物胺的方法。由于酪胺經(jīng)抑制后無(wú)電導(dǎo)信號(hào)，但酪胺具有較強(qiáng)的紫外吸收，因此酪胺采用紫外檢測(cè)，其他生物胺采用抑制電導(dǎo)檢測(cè)。通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜柱進(jìn)行分離，采用甲基磺酸溶液作為淋洗液進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，7種生物胺能達(dá)到較好的分離效果(圖1)。7種生物胺在0.1～100 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0，方法檢出限介于0.35～1.76 mg·kg-1，樣品加標(biāo)回收率均介于88.2%～108.8%，方法精密度(RSD)小于4.1%(n=6)，表明該方法簡(jiǎn)單、方便，具有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，適用于大黃魚(yú)中生物胺的測(cè)定。

2.2 不同貯藏溫度下大黃魚(yú)中生物胺的含量

溫度對(duì)大黃魚(yú)肌肉組織中生物胺的產(chǎn)生有重要影響，溫度越高，生物胺產(chǎn)生速度越快。從表1可知，大黃魚(yú)在0、4 ℃貯藏16 d，生物胺總量的變化范圍分別為1.41～17.53、1.53～187.63 mg·kg-1，在25 ℃僅貯藏6 d，生物胺總量的變化范圍為9.44～2 539.22 mg·kg-1。大黃魚(yú)整個(gè)貯藏過(guò)程中均未檢出His和Spe，而Spd本身存在于肌肉組織中，全程均有檢出，其含量隨著貯藏時(shí)間出現(xiàn)小幅波動(dòng)變化。0 ℃貯藏條件下，1～16 d，Put和Spd均有檢出，Tyr在第10天開(kāi)始檢出，整體呈緩慢增加的趨勢(shì)。4 ℃貯藏條件下，除Cad和Tyr均從第6天開(kāi)始有檢出、Put和Tyr在貯藏后期增加趨勢(shì)更為明顯外，其他變化情況與0 ℃貯藏條件下相似。25 ℃貯藏條件下，Put、Cad和Tyr隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)急劇增加，生物胺總量在第2 天就由9.44 mg·kg-1迅速升高至306.26 mg·kg-1左右。由此說(shuō)明，溫度越高，生物胺產(chǎn)生越快。在整個(gè)貯藏過(guò)程中，Cad的變化尤其顯著，Spd在整個(gè)貯藏期間變化不顯著，始終保持在較低水平。貯藏第4天開(kāi)始有Phe檢出，在4～6 d為5.03～85.20 mg·kg-1。鑒于大黃魚(yú)中生物胺含量較高且變化明顯的為Put、Cad和Tyr，因此，這3種生物胺可作為評(píng)價(jià)大黃魚(yú)鮮度品質(zhì)的特征生物胺。Kanki等[22]認(rèn)為，生物胺產(chǎn)生菌有嗜冷菌和嗜溫菌2大類(lèi)，魚(yú)體在不同溫度時(shí)帶的菌不同，不僅高溫時(shí)產(chǎn)生生物胺，低溫時(shí)也能產(chǎn)生生物胺，只不過(guò)低溫時(shí)菌體代謝緩慢，生物胺的產(chǎn)量低。

TVB-N是新鮮肉組織受到外界微生物感染，由于微生物生長(zhǎng)引起的脫羧、脫氨作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解而形成的產(chǎn)物，是水產(chǎn)品的一種特定腐敗指標(biāo)。由圖2可知，不同溫度貯藏條件下大黃魚(yú)中的生物胺總含量與TVB-N值變化趨勢(shì)整體一致，均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。0 ℃條件下生物胺總量和TVB-N值緩慢上升；4 ℃條件下的生物胺總量和TVB-N值隨著時(shí)間延長(zhǎng)增加，明顯高于0 ℃；25 ℃條件下的生物胺總量和TVB-N值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)急劇增加，顯著高于0 ℃和4 ℃，表明高溫大大加快了大黃魚(yú)的腐敗速度。大黃魚(yú)中生物胺在不同溫度貯藏條件下與腐敗指標(biāo)TVB-N值變化趨勢(shì)一致，由此表明，生物胺可以作為評(píng)價(jià)大黃魚(yú)腐敗程度的一種指標(biāo)。

表1不同貯藏溫度下大黃魚(yú)中生物胺含量

Table 1 Content of seven BAs in large yellow croaker stored at different temperature mg·kg-1

“—”表示未檢出。

—， Below detection limit.

圖2 大黃魚(yú)生物胺總量(A)與TVB-N(B)在不同貯藏溫度下的變化情況Fig.2 Changes of total BAs (A) and TVB-N (B) in large yellow croaker stored at different temperature

2.3 不同鹽分貯藏條件下大黃魚(yú)中生物胺含量

將不同量的NaCl涂在魚(yú)肉表面，于25 ℃貯藏，其生物胺含量見(jiàn)表2。不同鹽分條件下整個(gè)貯藏過(guò)程中均未檢出His和Spe，Spd含量變化范圍較小(0.76～7.92 mg·kg-1)。Put、Cad和Tyr均隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而增加，Phe則在貯藏第4或5天出現(xiàn)。與空白對(duì)照組(不添加NaCl)相比，其他含量鹽分貯藏條件下的生物胺均出現(xiàn)不同程度的下降，表明NaCl對(duì)大黃魚(yú)中生物胺的生成有明顯的抑制作用，而且鹽濃度越高，對(duì)生物胺的抑制效果越好。大黃魚(yú)在0、0.5%、2.0%和5.0% NaCl條件下貯藏6 d，其生物胺總量變化范圍分別為9.44～2 539.22、2.82～2 050.34、4.60～1 305.95、1.32～120.93 mg·kg-1。NaCl對(duì)Put、Cad和Tyr有相似的抑制效果，但對(duì)Spd影響不大。與空白對(duì)照組相比，NaCl含量為0.5%時(shí)，各生物胺含量略微有些下降，但效果不明顯；NaCl含量為2.0%時(shí)，3種特征生物胺含量相對(duì)空白對(duì)照下降50%左右；NaCl含量為5.0%時(shí)，Put、Cad、Tyr含量急劇下降，第6天時(shí)，Cad和Tyr含量分別為30.80、5.39 mg·kg-1，而此時(shí)空白對(duì)照組Cad和Tyr含量分別為1 533.50、469.80 mg·kg-1，同時(shí)Tyr的檢出時(shí)間也逐漸延后，5.0% NaCl貯藏條件下直到第5天才有檢出。Phe均在第4天后才有檢出，隨著NaCl含量的升高，Phe含量有所下降，當(dāng)NaCl含量達(dá)5.0%時(shí)，大黃魚(yú)肌肉中未檢測(cè)到Phe。

表2不同鹽分貯藏條件下大黃魚(yú)中生物胺含量

Table 2 Content of seven BAs in large yellow croaker stored with different NaCl concentration mg·kg-1

由圖3可知，不同鹽分貯藏條件下大黃魚(yú)中的生物胺總含量與TVB-N值變化趨勢(shì)相似，均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，隨著NaCl含量升高，生物胺總量和TVB-N值不斷下降，下降速度也隨著鹽濃度的增加而增大。當(dāng)NaCl含量達(dá)5.0%時(shí)，生物胺總含量與TVB-N值抑制效果最明顯，生物胺總量變化范圍為1.32～120.93 mg·kg-1，TVB-N值變化范圍為12.90～51.50 mg·100 mg-1。大黃魚(yú)中生物胺在不同鹽分貯藏條件下與腐敗指標(biāo)TVB-N值變化趨勢(shì)一致，表明適當(dāng)添加一定量的食鹽進(jìn)行貯藏可作為大黃魚(yú)保鮮方法的一種選擇。

圖3 大黃魚(yú)生物胺總量(A)與TVB-N(B)在不同鹽分貯藏條件下的變化情況Fig.3 Changes of total BAs (A) and TVB-N (B) in large yellow croaker stored with different NaCl concentrations

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了不同貯藏條件下大黃魚(yú)中生物胺的變化情況，包括0、4 ℃貯藏16 d、25 ℃貯藏6 d，以及不同鹽分(0、0.5%、2.0%、5.0% NaCl)于25 ℃貯藏6 d，大黃魚(yú)肌肉組織中7種生物胺含量和相對(duì)應(yīng)的腐敗指標(biāo)TVB-N值的變化情況。25 ℃條件下，大黃魚(yú)肌肉中生物胺和TVB-N值明顯高于0、4 ℃貯藏，特征生物胺Cad、Put和Tyr含量顯著增加，并隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)含量遠(yuǎn)大于其他生物胺，Phe含量在貯藏后期升高較快，Spd含量基本保持穩(wěn)定。通過(guò)添加不同含量NaCl進(jìn)行貯藏，在25 ℃條件下，Cad、Put、Phe和Tyr含量均顯著降低，其降低速度隨NaCl含量升高而增加，當(dāng)NaCl含量達(dá)5.0%時(shí)，大黃魚(yú)中生物胺和TVB-N值均明顯低于其他貯藏組，生物胺抑制效果顯著。綜上，高溫導(dǎo)致生物胺的急劇累積和TVB-N值的急劇增加，大黃魚(yú)新鮮度顯著降低，極易腐敗，低溫及適當(dāng)添加食鹽是控制生物胺產(chǎn)生的有效措施，有利于大黃魚(yú)的貯藏保鮮。