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    鄰苯二甲酸酯污染對(duì)黑土轉(zhuǎn)化酶與脲酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響

    2018-10-11 07:26:26陳文晶王志剛徐偉慧劉澤平呂智航王春龍
    關(guān)鍵詞:脲酶黑土抑制率

    陳文晶,王志剛,徐偉慧,劉澤平,呂智航,王春龍

    (齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

    鄰苯二甲酸酯(phthalate esters, PAEs)被用作化學(xué)增塑劑[1],在塑料制品中PAEs的含量高達(dá)80%[2]。2011年,中國(guó)PAEs消費(fèi)量達(dá)到220萬(wàn)t[3]。PAEs是半揮發(fā)性化合物[4],通過(guò)相對(duì)較弱的化學(xué)鍵(氫鍵或范德華力)連接塑料。隨著塑料工業(yè)的發(fā)展和PAEs的廣泛使用,有關(guān)PAEs污染和健康風(fēng)險(xiǎn)的報(bào)道越來(lái)越多,空氣、水、沉積物、土壤和食物中均有檢測(cè)到PAEs存在的報(bào)告[5-11]。PAEs是具有致畸、致癌、致突變作用,和內(nèi)分泌干擾性質(zhì)的化合物[12],因此,美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局和中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心均將鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate, DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)等PAEs列為優(yōu)先控制的污染物[13]。

    東北黑土在確保國(guó)家糧食安全方面具有重要的作用[14]。原始黑土土質(zhì)肥沃,但近幾十年來(lái),由于農(nóng)藥和化肥過(guò)度施用,以及薄膜覆蓋,PAEs持續(xù)進(jìn)入土壤環(huán)境,造成了一系列農(nóng)業(yè)生態(tài)問(wèn)題。土壤酶通常被認(rèn)作是土壤質(zhì)量指標(biāo)之一,也是微生物群體代謝狀態(tài)、土壤化學(xué)和物理?xiàng)l件的重要“傳感器”[15]。土壤脲酶、轉(zhuǎn)化酶在土壤養(yǎng)分與有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中起關(guān)鍵作用[16],相比土壤其他物理化學(xué)指標(biāo),其對(duì)外源刺激更加敏感[17],因此可以反映不同生態(tài)系統(tǒng)的土壤污染水平。

    在東北黑土中,PAEs類(lèi)污染物被廣泛檢出[18],改變了黑土微生物群落與功能[19],然而其對(duì)黑土酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響尚不清晰。故采用非緩沖液法,以東北黑土為供試土壤,PAEs中側(cè)鏈較短和側(cè)鏈較長(zhǎng)的DMP和DBP為代表,研究其對(duì)黑土中脲酶和轉(zhuǎn)化酶活性及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響,以期為環(huán)境保護(hù)和監(jiān)測(cè)提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    DMP和DBP(純度>99.5%)購(gòu)自天津市光富精細(xì)化工研究所。

    供試黑土采自黑龍江省克山農(nóng)場(chǎng)(125°39292′N(xiāo),48°304171′E),系未污染土樣。多點(diǎn)混合取樣法采集0~20 cm土樣,剔除石塊、草根等雜物后混勻,室溫風(fēng)干,過(guò)3 mm尼龍篩備用。供試土壤的理化性質(zhì):總有機(jī)碳2.68%,陽(yáng)離子交換量46.8 cmol·kg-1,土壤pH值6.3。

    1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與指標(biāo)檢測(cè)

    1.2.1 PAEs污染對(duì)土壤酶活的影響

    向5 g土樣中添加5 mL不同濃度(0、5、10、20、40 mg·kg-1)的PAEs溶液,混勻維持30 min后,加入15 mL 8%蔗糖溶液、5 mL H2O、0.5 mL甲苯,搖勻,37 ℃培養(yǎng)。定期取樣,采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定轉(zhuǎn)化酶活性[20],以生成葡萄糖的量表示。具體地:加入3 mL 0.022 mol·L-13, 5-二硝基水楊酸,沸水浴加熱5 min,取出后冷水浴冷卻至室溫,540 nm波長(zhǎng)處比色。每個(gè)處理重復(fù)3次,并設(shè)無(wú)底物、無(wú)土壤處理作為對(duì)照。

    向5 g土樣中添加5 mL不同濃度(0、5、10、20、40 mg·kg-1)的PAEs溶液,混勻維持30 min后,加入10 mL 0.1 mol·L-1的尿素溶液、20 mL H2O、0.5 mL甲苯,搖勻,37 ℃培養(yǎng)。定期取樣,采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定脲酶活性[20],以生成NH3-N的量表示。具體地:加入3 mL 0.012 mol·L-1次氯酸鈉和4 mL 0.27 mol·L-1苯酚鈉,顯色20 min后定容,578 nm波長(zhǎng)處比色。每個(gè)處理重復(fù)3次,并設(shè)無(wú)底物、無(wú)土壤處理作為對(duì)照。

    1.2.2 PAEs污染對(duì)土壤酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響

    向5 g土樣中添加5 mL不同濃度(0、5、10、20、40 mg·kg-1)的PAEs溶液,混勻維持30 min后,加入15 mL不同濃度(0.010、0.025、0.050、0.100 mo1·L-1)的蔗糖溶液、5 mL H2O、0.5 mL甲苯,37 ℃培養(yǎng),定期取樣,測(cè)定轉(zhuǎn)化酶活性。

    向5 g土樣中添加5 mL不同濃度(0、5、10、20、40 mg·kg-1)的PAEs溶液,混勻維持30 min后,加入10 mL不同濃度(0.010、0.025、0.050、0.100 mo1·L-1)的尿素溶液、20 mL H2O、0.5 mL甲苯,37 ℃培養(yǎng),定期取樣,測(cè)定脲酶活性。

    1.3 指標(biāo)測(cè)定

    1.3.1 定濃抑制率

    定濃抑制率(I)的計(jì)算公式為

    (1)

    式(1)中:y為PAEs處理下的酶活性;yc為未經(jīng)PAEs處理的酶活性。

    1.3.2 EDx值

    根據(jù)土壤酶活性和PAEs濃度作線性回歸,由擬合方程計(jì)算生態(tài)劑量(ED10),表示酶活性降低10%時(shí)的PAEs濃度,并將其作為表征土壤輕度污染的指標(biāo)。

    1.3.3 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

    酶催化活性(V)的特征由米氏方程描述:

    (2)

    式(2)中:米氏常數(shù)Km值通常表征酶與底物結(jié)合的牢固程度,μmol·L-1;最大反應(yīng)速度Vmax是總酶量的量度,可表征酶-底物復(fù)合物分解為酶和產(chǎn)物的速率,μmol·L-1·g-1·h-1[21];s代表底物濃度,mol·L-1。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    所有數(shù)據(jù)在Excel上進(jìn)行整理,在SPSS 22.0上進(jìn)行方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PAEs污染對(duì)黑土中酶活性的影響

    2.1.1 轉(zhuǎn)化酶

    由表1可知,隨著PAEs濃度升高,轉(zhuǎn)化酶定濃抑制率增大,說(shuō)明黑土中轉(zhuǎn)化酶活性受到PAEs持續(xù)增加的抑制作用。根據(jù)DMP、DBP對(duì)黑土中轉(zhuǎn)化酶活性的影響進(jìn)行回歸分析,計(jì)算得出黑土中轉(zhuǎn)化酶的生態(tài)劑量ED10分別為24.352和16.911 mg·kg-1。

    2.1.2 脲酶

    由表2可知,隨著PAEs濃度升高,脲酶定濃抑制率增大,說(shuō)明黑土中脲酶活性受到PAEs持續(xù)增加的抑制作用。根據(jù)DMP、DBP對(duì)黑土中脲酶活性的影響進(jìn)行回歸分析,計(jì)算得出黑土中脲酶的生態(tài)劑量ED10分別為5.015和8.677 mg·kg-1。

    2.2 PAEs污染對(duì)黑土中酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響

    2.2.1 轉(zhuǎn)化酶

    表1不同濃度PAEs對(duì)黑土中轉(zhuǎn)化酶活性及定濃抑制率的影響

    Table1Effect of different concentrations of PAEs on invertase activity and concentration inhibition rate in black soil

    污染物濃度Pollutant concentration/(mg·kg-1)DMP酶活Enzyme activity/(μg·g-1·h-1)定濃抑制率Concentration inhibitionrate/%DBP酶活Enzyme activity/(μg·g-1·h-1)定濃抑制率Concentration inhibitionrate/%011943.030±0.018 a0 b11943.030±0.018 a0 b511912.727±0.019 b0.254 a9956.162±0.004 b16.636 a1011685.455±0.013 b2.157 a9211.212±0.018 b22.874 a2010617.273±0.012 b11.101 a8784.444±0.014 b26.447 a4010094.545±0.020 b15.478 a8562.222±0.005 b28.308 a

    表中同列數(shù)據(jù)后無(wú)相同小寫(xiě)字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

    Data followed by no same letters indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

    表2不同濃度PAEs對(duì)黑土中脲酶活性及定濃抑制率的影響

    Table2Effect of different concentrations of PAEs on urease activity and concentration inhibition rate in black soil

    污染物濃度Pollutant concentration/(mg·kg-1)DMP酶活Enzyme activity/(μg·g-1·h-1)定濃抑制率Concentration inhibitionrate/%DBP酶活Enzyme activity/(μg·g-1·h-1)定濃抑制率Concentration inhibitionrate/%0141.279±0.028 a0 b141.279±0.028 a0 b599.876±0.023 b29.306 a100.500±0.022 b28.864 a1060.436±0.013 b57.611 a82.186±0.007 b41.827 a2058.474±0.016 b58.611 a76.023±0.005 b46.189 a4011.446±0.010 b91.898 a66.721±0.006 b52.774 a

    由表3可知,PAEs使黑土中轉(zhuǎn)化酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax和Km降低,屬于反競(jìng)爭(zhēng)抑制機(jī)制[22],即PAEs刺激了轉(zhuǎn)化酶與底物的親和力,但是削弱了酶-底物復(fù)合物分解為酶和產(chǎn)物的速率。

    2.2.2 脲酶

    由表4可知,PAEs使黑土中脲酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax和Km降低,屬于反競(jìng)爭(zhēng)抑制機(jī)制,即PAEs刺激了脲酶與底物的親和力,但是削弱了酶-底物復(fù)合物分解為酶和產(chǎn)物的速率。

    表3PAEs對(duì)黑土中轉(zhuǎn)化酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

    Table3Effect of PAEs on invertase kinetic parameters in black soil

    污染物濃度Pollutant concentration/(mg·kg-1)DMPKm/(μmol·L-1)Vmax/(μmol·L-1·g-1·h-1)DBPKm/(μmol·L-1)Vmax/(μmol·L-1·g-1·h-1)00.0217.2250.0217.22550.0145.6950.0236.609100.0115.1490.0175.787200.0135.2220.0165.565400.0124.9460.0145.071

    表4PAEs對(duì)黑土中脲酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

    Table4Effect of PAEs on urease kinetic parameters in black soil

    污染物濃度Pollutant concentration/(mg·kg-1)DMPKm/(μmol·L-1)Vmax/(μmol·L-1·g-1·h-1)DBPKm/(μmol·L-1)Vmax/(μmol·L-1·g-1·h-1)00.1060.4560.1060.45650.0370.1330.0340.409100.0270.0540.0230.254200.0170.0400.0150.154400.0050.0180.0120.133

    3 討論

    研究顯示,黑土中DBP的殘留量為2.75~14.62 mg·kg-1[23],不同季節(jié)黑土中PAEs的總體含量在1.37~4.90 mg·kg-1[18]。隨檢測(cè)方法、檢測(cè)時(shí)間,以及檢測(cè)位點(diǎn)不同,土壤環(huán)境中PAEs的殘留量檢測(cè)差異很大,因此,本實(shí)驗(yàn)中PAEs的處理濃度設(shè)定為0、5、10、20、40 mg·kg-1。

    土壤酶是土壤的重要生化部分,催化了土壤中眾多重要的生化反應(yīng),在物質(zhì)轉(zhuǎn)化、能量代謝、污染土壤修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[24-25]。同時(shí),土壤酶對(duì)土壤污染很敏感,可以作為環(huán)境污染的檢測(cè)指標(biāo)[26],如芳基硫酸酯酶活性可以表征土壤中阿魏酸的含量[27],脲酶活性可表征土壤一氯苯污染程度[28]。在本研究中,DMP污染黑土中轉(zhuǎn)化酶和脲酶的ED10分別為24.352和5.015 mg·kg-1,DBP污染黑土中轉(zhuǎn)化酶和脲酶的ED10分別為16.911和8.677 mg·kg-1。根據(jù)ED10值越小越敏感的原則,判定黑土中脲酶對(duì)PAEs污染比較敏感,可將脲酶活性作為PAEs污染黑土的生化指標(biāo)。

    酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究土壤酶促反應(yīng)機(jī)制的重要手段之一,經(jīng)典的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)可用來(lái)描述土壤中催化反應(yīng)的進(jìn)程,有助于了解土壤酶的作用機(jī)理[29]。研究顯示:隨著草甘膦濃度的增大,Vmax、Vmax/Km及K值增大,說(shuō)明草甘膦的加入增加了轉(zhuǎn)化酶酶促反應(yīng)的初速度,進(jìn)而激活了轉(zhuǎn)化酶的活性[20]。一氯苯對(duì)堿性磷酸酶的作用機(jī)制為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制[28],鄰二氯苯對(duì)塿土轉(zhuǎn)化酶的作用機(jī)制以非競(jìng)爭(zhēng)性抑制為主[29]。但本研究顯示, PAEs使黑土中轉(zhuǎn)化酶和脲酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax和Km降低,屬于反競(jìng)爭(zhēng)抑制機(jī)制,即PAEs刺激了脲酶和轉(zhuǎn)化酶與底物的親和力,但是削弱了酶-底物復(fù)合物分解為酶和產(chǎn)物的速率,從而抑制其酶活性。

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