臺(tái)州獼猴桃潰瘍病病原菌分子鑒定及藥劑篩選

鐘永軍，何昕蔚，余達(dá)勇，蔣晶晶，江景勇

(1.中國(guó)科學(xué)院寧波材料技術(shù)與工程研究所 功能材料與納米器件事業(yè)部，浙江 寧波 315201；2.臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000； 3.臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臨海 317000)

近年來(lái)，臺(tái)州獼猴桃尤其是紅陽(yáng)獼猴桃的種植面積迅速擴(kuò)大，但在種植過(guò)程中細(xì)菌性潰瘍病頻發(fā)，給臺(tái)州獼猴桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展帶來(lái)了挑戰(zhàn)。獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病是一種由丁香假單胞獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidae，Psa)引起的毀滅性病害[1-2]。由于地理環(huán)境、氣候、獼猴桃品種等因素的不同，各地發(fā)現(xiàn)的獼猴桃潰瘍病病原菌在基因型、致病能力和流行性等方面具有一定的獨(dú)特性[3-4]。根據(jù)遺傳差異和毒素的產(chǎn)生能力，Psa可分為4種生物型(biovar)，分別為biovar 1、2、3、5[5]。其中，biovar 1于1984年在日本發(fā)現(xiàn)，并在隨后1992年意大利暴發(fā)的獼猴桃潰瘍病害中被檢測(cè)到，能產(chǎn)生菜豆丁香假單胞菌毒(phaseolotoxin)；biovar 2僅在韓國(guó)發(fā)現(xiàn)，能產(chǎn)生冠菌素(coronatine)；biovar 3近年來(lái)在全球普遍流行，沒(méi)有檢測(cè)出毒素基因；biovar 5最早于2012年在日本發(fā)現(xiàn)，目前在日本的局部地區(qū)流行[6-7]。然而，國(guó)內(nèi)各地對(duì)獼猴桃種植區(qū)Psa病菌的生物型分型的報(bào)道還比較少。

化學(xué)藥物防治是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外獼猴桃種植中的主要防治手段之一。在歐洲，含銅制劑被大量用于防治獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病；而在亞洲，鏈霉素也是主要的防治藥物。由于鏈霉素和含銅制劑的長(zhǎng)期使用，日本、韓國(guó)等國(guó)的Psa病原菌出現(xiàn)了對(duì)鏈霉素和銅制劑的耐藥性，限制了鏈霉素和銅制劑的防治效果[8-10]。此外，由于地理環(huán)境、氣候、獼猴桃品種等因素的差異，各地流行的病原菌在基因型、致病能力、傳染性和藥物敏感性等方面不盡相同，使得簡(jiǎn)單套用其他地區(qū)的防治方法未能達(dá)到理想的效果。

篩選新型的防治藥劑是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外獼猴桃潰瘍病防治中的一個(gè)重要課題。無(wú)機(jī)納米抗菌劑具有抗菌廣譜性、化學(xué)穩(wěn)定性、緩釋性及環(huán)境友好等特點(diǎn)，越來(lái)越為人們所關(guān)注。納米氧化鋅(ZnO)是尺寸在1～100 nm的無(wú)機(jī)納米材料，因其價(jià)格低廉、無(wú)需紫外照射就能表現(xiàn)出良好的抗菌效能、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前研究較為活躍的綠色抗菌劑之一[11-13]。關(guān)于納米ZnO抗菌性能的產(chǎn)生機(jī)制主要有3個(gè)假說(shuō)，即光催化抗菌機(jī)制、金屬離子溶出抗菌機(jī)制和活性氧抗菌機(jī)制[12]。目前，納米ZnO的應(yīng)用研究主要集中在生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在農(nóng)業(yè)病原菌防治應(yīng)用方面的相關(guān)研究還比較少。本研究從臺(tái)州當(dāng)?shù)刂饕J猴桃果園染病枝條中分離病原菌，并對(duì)其進(jìn)行分子鑒定，旨在掌握本地獼猴桃潰瘍病病原菌的特征。同時(shí)，對(duì)分離的病原菌進(jìn)行防治藥物篩選，指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年6月至2017年4月，于臺(tái)州街頭的紅陽(yáng)獼猴桃種植園，采集被潰瘍病感染的枝條和樹(shù)皮。供試菌株為丁香假單胞菌番茄變種DC3000(由臺(tái)州學(xué)院張慧娟老師惠贈(zèng))，以及陜西分離的丁香假單胞獼猴桃致病變種(由臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院惠贈(zèng))。營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g·L-1，牛肉浸出粉3.0 g·L-1，氯化鈉5.0 g·L-1，pH 7.2；若配置營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)，加入瓊脂15.0 g·L-1。供試農(nóng)用殺菌劑使用時(shí)根據(jù)其說(shuō)明書(shū)中推薦的最低倍數(shù)稀釋。

納米氧化鋅(直徑50 nm)購(gòu)自阿拉丁。其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)或上海生工。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離

取新鮮的染病枝條，洗凈后切成小塊，無(wú)菌水淋洗3遍后用70%乙醇浸泡消毒1～2 min。取出后用無(wú)菌水淋洗3遍，再將樣品放入10%的H2O2溶液10 min。取出后再用無(wú)菌水淋洗3遍，切除樣品邊緣接觸殺菌劑的部分，將剩余的樣品碾碎后放入無(wú)菌水中劇烈振搖混勻。最后將上述充分混勻后的樣品做連續(xù)梯度稀釋?zhuān)瑥拿總€(gè)稀釋梯度取100 μL涂布于NA平板，倒置于26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后，挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 病原菌分子鑒定

分離得到的菌株先通過(guò)特異引物PSA-F/R確認(rèn)是否為Psa陽(yáng)性，再使用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F/1525R擴(kuò)增，最后用biovar分型引物檢測(cè)Psa病原菌的生物型。引物信息如表1所示。得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后都送往上海生工測(cè)序。

1.2.3 病原菌接種感染

病原菌接種感染采用創(chuàng)傷接種法[18]。將2 mL新鮮培養(yǎng)的菌液(D600=1.2)離心，棄上清，用100 μL 0.9%氯化鈉溶液重懸，取2 μL重懸后的菌液滴加于獼猴桃嫩葉背面葉脈處，然后使用無(wú)菌注射器刺穿葉脈，使菌液直接接觸嫩葉傷口。0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為對(duì)照。接種后，將整株植物放置于18 ℃光照培養(yǎng)箱，其中100%光照強(qiáng)度10 h，33%光照強(qiáng)度4 h，無(wú)光照10 h，每天觀察記錄。

表1引物序列

Table1Primer sequences

引物名稱(chēng)Primer name特異性Specificity引物序列 (5′-3′)Primer sequences (5′-3′)產(chǎn)物大小Product size/bp參考文獻(xiàn)ReferencePSA-FPSA-Rpv. actinidiaeCAGAGGCGCTAACGAGGAAACGAGCATACATCAACAGGTCA311Balestra等[14]PsaJ-FPsaJ-Rbiovar 1GACGTCGACGACAAGGTGATAGTAAACCGTGCCGTCATCTC481Lee等[15]PsaK-FPsaK-Rbiovar 2GACAAAGCCAAAAAGGCGATGCCAAGCCCAAGTATCCAAGC413Lee等[15]hopH1-FhopH1-Rbiovar 3CATCTCGATATCCAGGCATCTTCAGCTCGGATGGAGTTCT605Ferrante等[16]hopZ5-F2hopZ5-R2biovar 3CAGGAATTCATGACTTCTCATAGTCTCGAAGATTCAATGG630Sawada等[7]Con044FCon044Rbiovar 5AAGCGCCTTAATCTCGTTCAATTCCGGATTGGGTATCACA470Fujikawa等[6]27F16S rRNAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG1535Lane[17]1525RAAAGGAGGTGATCCAGCC

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

農(nóng)用殺菌劑藥敏試驗(yàn)采用預(yù)加菌液傾注平板法和打孔抑菌圈法[19]。向15 mL無(wú)菌離心管中加入50 ℃的NA培養(yǎng)基，將100 μL新鮮培養(yǎng)菌液加入其中并搖勻，再迅速倒入培養(yǎng)皿中靜置10 min，用6 mm圓形打孔器在每個(gè)平板上打3個(gè)孔，孔與孔之間的距離不小于2 cm，向每個(gè)孔中加藥30 μL，平放于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.5 納米氧化鋅MIC測(cè)定

納米氧化鋅最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定參考Padmavathy等[20]的方法。將滅菌后的納米氧化鋅加入無(wú)菌去離子水中，超聲波處理10 min，使溶液形成穩(wěn)定的懸濁液，再用2倍稀釋法對(duì)納米氧化鋅溶液作梯度稀釋。向1.8 mL的NB培養(yǎng)基中加入100 μL的納米氧化鋅稀釋溶液和100 μL的菌液，使最終菌液濃度控制在5×105cfu·mL-1左右，納米氧化鋅濃度為200、100、50、25、12.5 μg·mL-1?；靹蚝笾糜?6 ℃搖床培養(yǎng)24 h，加入40 μL的2 mol·L-1鹽酸溶解氧化鋅顆粒，肉眼觀察培養(yǎng)基不混濁的最低納米氧化鋅濃度，即是其MIC值。

1.2.6 時(shí)間-殺菌曲線的測(cè)定

向1.8 mL的NB培養(yǎng)基中加入100 μL的納米氧化鋅稀釋溶液和100 μL的菌液，使最終菌液濃度控制在5×105cfu·mL-1左右，納米氧化鋅濃度為200、100、50、25 μg·mL-1?；靹蚝笾糜?6 ℃搖床培養(yǎng)。在培養(yǎng)的1、2、4 h取樣，涂平板計(jì)菌落數(shù)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)的自然對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制殺菌曲線[21]。重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離鑒定

用引物PSA-F/R對(duì)分離的疑似病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為300 bp特異條帶的菌株為Psa陽(yáng)性(如圖1-A中JT1、JT2、JT4、JT5、JT6和JT7)。用16S rRNA通用引物27F/1525R對(duì)Psa陽(yáng)性菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，所分離菌株都為Psa陽(yáng)性菌株。將測(cè)序結(jié)果上傳GenBank，登錄號(hào)分別為MF950900、MF950901、MF950902、MF950903、MF950904和MF950905。

分別利用biovar 1特異引物(PsaJ-F/PsaJ-R)、biovar 2特異引物(PsaK-F/PsaK-R)、biovar 3特異引物(hopZ5-F2/hopZ5-R2和hopH1-F/hopH1-R)和biovar 5特異引物(Con044F/Con044R)對(duì)Psa陽(yáng)性菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，只有biovar 3特異引物能擴(kuò)增出目的條帶(如圖1-B、C)，表明這些Psa菌株都是biovar 3型。

2.2 回接感染試驗(yàn)

將分離的Psa病原菌株回接感染盆栽獼猴桃葉片。典型的結(jié)果如圖2所示，病原菌株接種感染后，葉片接種病原菌處出現(xiàn)直徑為1～2 mm棕黑色斑點(diǎn)(圖2“*”標(biāo)記處)，葉緣出現(xiàn)棕色紋路和斑塊(圖2 Psa病原菌接種“△”標(biāo)記處)，表明所分離的Psa菌株具有致病性。

2.3 農(nóng)用殺菌劑的藥敏分析

對(duì)23種農(nóng)用殺菌劑進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同農(nóng)用殺菌劑的抑菌效果差異很大。其中，12種農(nóng)用殺菌劑對(duì)臺(tái)州分離的病原菌株都有抑菌作用(可見(jiàn)明顯的抑菌圈)；而另外11種農(nóng)用殺菌劑對(duì)病原菌都沒(méi)有抑菌作用(表2)。根據(jù)抑菌圈的大小，病原菌對(duì)四環(huán)素、乙蒜素和丁子香酚敏感(抑菌圈直徑≥15 mm)，對(duì)辛菌胺醋酸鹽、嗅菌·咪鮮胺、中生菌素、中生·寡糖素較為敏感(抑菌圈直徑介于10～15 mm)。

A，引物PSA-F/R的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果； B、C，biovar 3檢測(cè)，其中B為引物hopZ5-F2/hopZ5-R2的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，C為引物hopH1-F/hopH1-R的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。M，DNA marker；JT1、JT2、JT4、JT5、JT6、JT7為本研究分離的Psa陽(yáng)性菌株編號(hào)；P，陽(yáng)性菌株；DC3000(丁香假單胞菌番茄變種)，陰性對(duì)照。A， Electrophoresis analysis of PCR product by primer PSA-F/R; B， Electrophoresis analysis of PCR product by primer hopZ5-F2/hopZ5-R2; C， Electrophoresis analysis of PCR product by primer hopH1-F/hopH1-R; M， DNA marker; JT1， JT2， JT4， JT5， JT6， JT7， Isolated Psa strain numbers; P， Positive control; DC3000， Negative control.圖1 PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product

“*”標(biāo)記為接種Psa病原菌株；“↑”標(biāo)記為陰性對(duì)照刺破點(diǎn)?！?”， Inoculate Psa strain; “↑”， Negative control.圖2 Psa病原菌接種感染獼猴桃葉片F(xiàn)ig.2 Kiwifruit leaves inoculated with Psa strain

2.4 納米氧化鋅的抑菌研究

納米氧化鋅的MIC檢測(cè)結(jié)果表明，納米氧化鋅對(duì)臺(tái)州分離的Psa病原菌的MIC值為50 μg·mL-1(圖3-A)。將0、25、50、100和200 μg·mL-1納米氧化鋅與Psa病原菌進(jìn)行混合孵育，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣并記錄活菌數(shù)。結(jié)果表明，納米氧化鋅的殺菌能力隨著納米氧化鋅濃度和作用時(shí)間的增加而增強(qiáng)(圖3-B)。

3 討論

紅陽(yáng)品種獼猴桃是較易感染獼猴桃潰瘍病的品種[22]，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于該品種Psa病原菌的biovar分型鑒定的相關(guān)報(bào)道還不多。本研究從臺(tái)州的紅陽(yáng)獼猴桃發(fā)病果園分離到Psa病原菌，分子鑒定結(jié)果表明該P(yáng)sa病原菌屬于biovar 3型。這與胡月等[23]最近報(bào)道的四川多地獼猴桃潰瘍病菌為biovar 3型結(jié)果一致。

本研究對(duì)23種農(nóng)用殺菌劑進(jìn)行了篩選，結(jié)果顯示四環(huán)素和乙蒜素對(duì)本研究分離的Psa病原菌抑菌效果較好。這與陽(yáng)廷密等[24]報(bào)道的結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)乙蒜素和四環(huán)素對(duì)獼猴桃葉片潰瘍病的防治效果較好。鏈霉素和銅制劑是目前國(guó)內(nèi)防治獼猴桃潰瘍病普遍使用的藥劑，如秦虎強(qiáng)等[25]用田間全樹(shù)噴霧和樹(shù)干涂藥試驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)，農(nóng)用鏈霉素和氫氧化銅預(yù)防效果較好(超過(guò)60%)。值得注意的是，李春游等[26]對(duì)2010—2013年分離自陜西省關(guān)中地區(qū)的102株P(guān)sa病菌進(jìn)行鏈霉素抗藥性監(jiān)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15.7%的Psa菌株MIC≥45 μg·mL-1，且分離自紅陽(yáng)獼猴桃品種的Psa菌株對(duì)鏈霉素的MIC值明顯高于分離自秦美品種的Psa菌株。在本研究中，Psa菌株對(duì)農(nóng)用硫酸鏈霉素、氫氧化銅及多種銅制劑并不敏感(表2)。這些差異是否是本研究采用打孔抑菌圈法、Psa病菌差異、不同農(nóng)藥廠家藥劑差異等引起，有待進(jìn)一步探究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅對(duì)Psa菌株的MIC值為50 μg·mL-1，且殺菌效果具有濃度和作用時(shí)間依賴(lài)性，顯示了納米氧化鋅在獼猴桃潰瘍病防治上的潛在應(yīng)用價(jià)值。接下來(lái)，有必要對(duì)本研究中有抑菌效果的藥物開(kāi)展田間試驗(yàn)，以進(jìn)一步明確這些藥物在田間的防治效果。

表2農(nóng)用殺菌劑及抑菌圈直徑

Table2Farm fungicides and the diameter of inhibitory rings

殺菌劑名稱(chēng)Fungicide name生產(chǎn)公司Company稀釋倍數(shù)Dilution抑菌圈直徑Inhibitory ring/mm四環(huán)素Tetracycline遼寧微科生物工程有限公司Liaoning Wkioc Bioengineering Co., Ltd.100020.33±2.08乙蒜素Ethylicin河南中威高科技化工有限公司Henan Zhongwei High-tech Chemical Co., Ltd.40018.33±5.13丁子香酚Eugenol河南神潤(rùn)生物科技有限公司Henan Shenrun Biological Technology Co., Ltd.25015.33±0.58辛菌胺醋酸鹽Xinjunan acetate西安近代農(nóng)藥科技股份有限公司Xian Modern Pesticide Co., Ltd.20012.33±1.15嗅菌·咪鮮胺Bromothalonil·Prochloraz陜西康禾立豐生物科技藥業(yè)有限公司Shanxi Konho Biological Technology Co., Ltd.50011.67±2.89中生菌素Zhongshengmycin江西正邦生物化工有限公司Jiangxi Zhengbang Bio-chemical Co., Ltd.75011.00±1.00中生·寡糖素Zhongshengmycin·Oligosaccharin江蘇明德立達(dá)作物科技有限公司Jiangsu Mindleader Corp Science Co, Ltd.160010.00±0.01琥膠肥酸銅Copper(succinate+glutarate+adipate)齊齊哈爾四友化工有限公司Qiqihaer Siyou Chemical Co, Ltd.1009.00±0.01多抗霉素polyoxin山東聊成賽德農(nóng)藥有限公司Shandong Liaocheng Saide Pesticide Co, Ltd10009.00±1.00腐必清Fubiqing河南神潤(rùn)生物科技有限公司Henan Shenrun Biological Technology Co., Ltd.3008.33±0.58腐皮消Fupixiao鄭州勞恩格潤(rùn)生物科技有限公司Zhengzhou Laoengerun Biological Technology Co., Ltd.5007.33±0.58氯溴異氰尿酸Chloroisobromine cyanuric acid河南銀田精細(xì)化工有限公司Henan Yintian Fine Chemical Co., Ltd.3507.00±0.00嗎胍·乙酸銅Moroxydine·Copper(II) acetate山東鑫星農(nóng)藥有限公司Shandong Xinxing Pesticide Co., Ltd.130—?dú)溲趸~Copper hydroxide上海杜邦農(nóng)化有限公司Shanghai Dupont Agricultural Chemical Co., Ltd.750—百菌清Chlorothalonil利民化工有限公司Limin Chemical Co., Ltd.1000—葉枯唑Bismerthiazol一帆生物科技集團(tuán)有限公司Yifan Biotechnology Group Co. Ltd.300—氧化亞銅Copper(I) oxide北京十方技術(shù)有限責(zé)任公司Beijing Sofine Technology Co. Ltd.1000—農(nóng)用硫酸鏈霉素Streptomycin sulfate重慶豐化科技有限公司Chongqing Fenghua Technology Co. Ltd.1000—農(nóng)用新植霉素New mycophencin青島田園科技有限公司Qingdao Tianyuan Technology Co. Ltd.1000—啶酰菌胺Boscalid巴斯夫(中國(guó))有限公司BASF (China) Co., Ltd.1000—苯甲·多抗Difenoconazole·Polyoxin安徽績(jī)溪農(nóng)華生物科技有限公司Jixi Nonghua Biological Technology Co., Ltd.1000—松脂酸酮Abietic acid copper山東省煙臺(tái)博瑞特生物科技有限公司Yantai Boruite Biological Science and Technology Co., Ltd.500—絡(luò)氨銅Cupric-amminium complexion山西永和化工有限公司Shanxi Yonghe Chemical Co., Ltd.50—

“—”表示無(wú)可見(jiàn)抑菌圈。

“—” indicated no obvious inhibitory rings.

A，納米氧化鋅MIC測(cè)定；B，納米氧化鋅時(shí)間-殺菌曲線。A， MIC analysis of nano zinc oxide; B， Time-kill curve of nano zinc oxide.圖3 納米氧化鋅抑菌分析Fig.3 Antibacterial analysis of nano zinc oxide

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院寧波材料技術(shù)與工程研究所的吳愛(ài)國(guó)研究員對(duì)本文涉及的納米材料方面的指導(dǎo)和幫助。