蝦源蠟樣芽孢桿菌D7的生態(tài)安全性評價(jià)

張洪玉，王海波，2，楊移斌，趙明軍，夏 磊，2，*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 無公害漁藥創(chuàng)制中心，北京100141；2.北京鑫洋水產(chǎn)高新技術(shù)有限公司，北京102488；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430233；4.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 漁業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略研究中心，北京 100141)

益生菌由于其獨(dú)特的功能，在養(yǎng)殖過程中備受青睞。隨著益生菌研究的不斷深入，水產(chǎn)用益生菌使用的安全性受到越來越多的關(guān)注[1-6]。由于水產(chǎn)用益生菌的種類、使用方法及來源較其他產(chǎn)業(yè)存在較大差異，對水產(chǎn)用益生菌進(jìn)行安全評價(jià)時(shí)，不僅要考慮其動(dòng)物的毒性作用，還應(yīng)該考查其對水體生態(tài)環(huán)境的影響。

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)主要功能是調(diào)節(jié)腸道菌群和治療腹瀉，其作為生物制品已經(jīng)被批準(zhǔn)用于人體及畜禽養(yǎng)殖[7-8]。Navinchandran等[9]研究表明，蠟樣芽孢桿菌可提高斑節(jié)對蝦的免疫力和抗病力，促進(jìn)其生長。水體中添加105～106cfu·mL-1蠟樣芽孢桿菌PC465，可以提高凡納濱對蝦抗白斑綜合征感染能力[10]。飼料中添加蠟樣芽孢桿菌及其生物膜，可改變對蝦腸道的微生物組成，提高凡納濱對蝦生長速度、提高抗病能力[11]。本研究團(tuán)隊(duì)從凡納濱對蝦腸道中分離到蠟樣芽孢桿菌D7，拌餌投喂，可顯著促進(jìn)凡納濱對蝦生長，提高其機(jī)體免疫力和抗氨氮的作用[12-13]。

本研究對蠟樣芽胞桿菌D7進(jìn)行了生態(tài)安全性評價(jià)，分別研究了蠟樣芽孢桿菌對水質(zhì)3項(xiàng)指標(biāo)、浮游藻類、水生動(dòng)物等水生態(tài)系統(tǒng)的影響，為該菌株產(chǎn)業(yè)化提供支撐，也對水產(chǎn)益生菌生態(tài)安全性評價(jià)方法進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蠟樣芽孢桿菌菌種由本課題組從凡納濱對蝦腸道中分離鑒定[14-15]，并在中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，保藏號(hào)CGMCC No.9139。進(jìn)行各試驗(yàn)前，將菌株送到北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rDNA測序，經(jīng)測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，與蠟樣芽孢桿菌一致性為100%。

普通小球藻(Chlorellavulgaris)購自中國科學(xué)院淡水藻種庫，藻類培養(yǎng)基為BG11，由藻種庫提供。大型蚤(Daphniamagna)、斑馬魚(Danioretio)購自北京潘家園觀賞魚市場，草魚(Ctenopharyngodonidella)購自北京市龍池養(yǎng)殖場，選擇規(guī)格相近[體質(zhì)量(30.3±4.8 g)]、健康活潑的進(jìn)行試驗(yàn)。凡納濱對蝦購自河北黃驊中捷農(nóng)場個(gè)體養(yǎng)殖場，選擇規(guī)格相近 [體長(5.2±0.7) cm]、活力好的進(jìn)行試驗(yàn)，淡化鹽度到0.3%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蠟樣芽孢桿菌對氨氮、亞硝酸鹽及磷酸鹽的影響

試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[16-17]并進(jìn)行改進(jìn)，具體如下：取室外斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)養(yǎng)殖廢水，加入適量的NH4Cl、NaNO2及KH2PO4，使水體中初始氨氮、亞硝態(tài)氮、磷酸鹽濃度分別為2、2、0.6 mg·L-1。各試驗(yàn)分別設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)。在氨氮、亞硝酸鹽及磷酸鹽初始濃度下分別接種蠟樣芽孢桿菌，使菌體終濃度達(dá)到0、104、105、106、107、108cfu·mL-1。分別于0、2、4、8、14 d取樣測定。氨氮采用納氏試劑分光光度法測定，亞硝態(tài)氮采用分光光度法，總磷采用鉬酸銨分光光度法測定。

1.2.2 蠟樣芽孢桿菌對小球藻生長的影響

試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[18-20]并進(jìn)行改進(jìn)，具體如下：設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)。將蠟樣芽孢桿菌加入適量無菌蒸餾水中于32 ℃水浴重懸，無菌操作加入到100 mL BG11藻類培養(yǎng)基中，使菌終濃度達(dá)到0、104、105、106、107、108cfu·mL-1，分別加入初始細(xì)胞濃度為105mL-1的小球藻藻液 10 mL?；旌弦涸?25±1)℃、連續(xù)均勻光照(8 000 lx)、定期人工搖動(dòng)等條件下連續(xù)培養(yǎng)72 h，每24 h取樣1次，紫外分光光度計(jì)測定光密度值。根據(jù)Arnon公式[21]計(jì)算葉綠素a含量。以葉綠素a為縱坐標(biāo)軸、以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制小球藻的生長曲線，觀察蠟樣芽孢桿菌對小球藻生長的影響。

1.2.3 蠟樣芽孢桿菌對大型蚤急性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[22]。試驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度為(25±1)℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx，每天光照10 h。設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，各處理組蠟樣芽孢桿菌終濃度分別為0、104、105、106、107、108cfu·mL-1。將不同濃度蠟樣芽孢桿菌溶液置于100 mL燒杯中，每個(gè)燒杯放置大型蚤20個(gè)，分別于1、2、4、8、16、24、48、96 h定期進(jìn)行觀察，記錄大型蚤行為特征。

1.2.4 蠟樣芽孢桿菌對斑馬魚、草魚、對蝦的急性毒性測定

3種養(yǎng)殖動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)均在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院無公害漁藥創(chuàng)制中心循環(huán)水系統(tǒng)進(jìn)行。試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[23]。試驗(yàn)期水溫控制在24～26 ℃，pH 7.2～7.5。

斑馬魚急性毒性試驗(yàn)：設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾，養(yǎng)殖水體100 L。將蠟樣芽孢桿菌加到試驗(yàn)缸，使菌終濃度分別為0、104、105、106、107、108cfu·mL-1，分別于1、2、4、8、16、24、48、96 h觀察魚體反應(yīng)能力，游動(dòng)能力、呼吸能力等指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)死亡情況。

凡納濱對蝦急性毒性試驗(yàn)：設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾，養(yǎng)殖水體200 L，水體鹽度調(diào)到0.3‰。將蠟樣芽孢桿菌分別加到試驗(yàn)缸，使菌終濃度分別為0、104、105、106、107、108cfu·mL-1，分別于1、2、4、8、16、24、48、96 h觀察對蝦的應(yīng)激能力，游動(dòng)能力等指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)死亡情況。

草魚急性毒性試驗(yàn)：設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾，養(yǎng)殖水體200 L。分別口服灌胃濃度為0、108、109、1010、1011、1012cfu·kg-1蠟樣芽孢桿菌。按照灌胃量，將菌泥全部重懸到0.4 mL超純水中，并加入少量食用色素以便觀察回吐情況。通過灌胃針灌胃，對照組灌胃等體積的含有食用色素的超純水，灌胃前禁食24 h，灌胃后48 h投喂經(jīng)過滅菌的商品飼料。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蠟樣芽孢桿菌對氨氮、亞硝酸鹽、磷酸鹽的影響

不同濃度蠟樣芽孢桿菌對氨氮的影響見圖1。研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度下(107、108cfu·mL-1)，第2、4、8、14天蠟樣芽孢桿菌顯著降低水體中氨氮濃度(P<0.05)；較低濃度下(104、105cfu·mL-1)，除第4天與對照組差異顯著(P<0.05)外，其余時(shí)間點(diǎn)水體中氨氮濃度均無顯著差異。蠟樣芽孢桿菌濃度為106cfu·mL-1時(shí)，在第2、4天水體中氨氮濃度與對照組差異顯著(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)差異不顯著。

柱上無相同小寫字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。C0～C5水體中蠟樣芽孢桿菌濃度分別為0、104、105、106、107、108 cfu·mL-1。下同。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05. C0～C5 represented groups of different Bacillus cereus concentration among 0、104、105、106、107、108 cfu·mL-1. The same as below.圖1 不同濃度蠟樣芽孢桿菌對氨氮含量的影響Fig.1 Effects of different concentration of Bacillus cereus on ammonia nitrogen

不同濃度蠟樣芽孢桿菌對亞硝酸鹽的影響見圖2。較高濃度下(107、108cfu·mL-1)，第2、4、8、14天水體中亞硝酸鹽濃度較對照組顯著降低(P<0.05)；較低濃度下(104cfu·mL-1)，第8天水體中亞硝酸鹽濃度較對照組顯著降低(P<0.05)；蠟樣芽孢桿菌濃度為105、106cfu·mL-1時(shí)，在第4、8天水體中亞硝酸鹽濃度較對照組顯著降低(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)差異不顯著。

不同濃度蠟樣芽孢桿菌對磷酸鹽的影響見圖3。蠟樣芽孢桿菌濃度為105、106、108cfu·mL-1處理2 h后，水體中磷酸鹽濃度較對照組顯著下降(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)均未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)。

2.2 不同濃度蠟樣芽孢桿菌對小球藻的影響

在小球藻培養(yǎng)液中添加不同濃度蠟樣芽孢桿菌后，在各時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生不同的影響(圖4)。24 h時(shí)，106、107、108cfu·mL-13個(gè)較高濃度處理組較對照組差異顯著(P<0.05)，104、105cfu·mL-12個(gè)濃度處理組較對照組差異不顯著；48 h時(shí)，106、107、108cfu·mL-13個(gè)濃度處理組較對照組差異極顯著(P<0.01)，104、105cfu·mL-12個(gè)濃度處理組較對照組差異不顯著；72 h時(shí)，104、105cfu·mL-12個(gè)濃度處理組較對照組差異顯著(P<0.05)，106、107、108cfu·mL-13個(gè)濃度處理組較對照組差異極顯著(P<0.01)。從整體趨勢來看，蠟樣芽孢桿菌在104～108cfu·mL-1濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)小球藻的繁殖，并與菌濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

圖2 不同濃度蠟樣芽孢桿菌對亞硝酸鹽含量的影響Fig.2 Effects of different concentration of Bacillus cereus on nitrite

圖3 不同濃度蠟樣芽孢桿菌對磷酸鹽含量的影響Fig.3 Effects of different concentration of Bacillus cereus on phosphate

圖4 蠟樣芽孢桿菌對小球藻葉綠素a含量的影響Fig.4 Effect of different concentrations of Bacillus cereus on chlorophyll-a of Chlorella vulgaris

2.3 不同濃度蠟樣芽孢桿菌對大型蚤、斑馬魚、草魚、對蝦的急性毒性作用

水體中蠟樣芽孢桿菌濃度為104、105、106、107、108cfu·mL-1時(shí)，大型蚤、斑馬魚、對蝦均未出現(xiàn)死亡，活動(dòng)能力正常。蠟樣芽孢桿菌灌胃劑量為108、109、1010、1011、1012cfu·kg-1時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)處理組均未發(fā)現(xiàn)死亡。

3 討論

水產(chǎn)微生態(tài)制劑同其他產(chǎn)業(yè)微生態(tài)制劑在使用方式上有一定的差異。水產(chǎn)用微生態(tài)制劑既有潑灑到水體中用于水體環(huán)境改良，又可添加到飼料中。潑灑用微生態(tài)制劑使用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于拌餌投喂量。

養(yǎng)殖水域生態(tài)系統(tǒng)由非生物環(huán)境和生物群落組成。非生物環(huán)境中營養(yǎng)鹽類是養(yǎng)殖過程中重點(diǎn)關(guān)注的指標(biāo)，氨氮及亞硝酸鹽含量過高，會(huì)對水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生一定的毒性。高密度、高投餌的養(yǎng)殖池塘中，無機(jī)磷含量普遍偏高[24]。本研究以氨氮、亞硝酸鹽及磷酸鹽為營養(yǎng)鹽指標(biāo)評價(jià)了蠟樣芽孢桿菌對3項(xiàng)指標(biāo)的影響，結(jié)果表明，高濃度能夠顯著降低氨氮及亞硝酸鹽，低濃度對氨氮及亞硝酸鹽沒有持續(xù)顯著的影響，這同王春迪等[10]的結(jié)果相近。

小球藻作為綠藻門的代表藻種之一，由于易于培養(yǎng)、計(jì)數(shù)等優(yōu)點(diǎn)，成為學(xué)者們藻類生態(tài)評價(jià)中最常用的一種[25]。宋增福等[5]利用小球藻評價(jià)地衣芽孢桿菌T-1對藻類生長的影響，對小球藻沒有毒性作用。曹海鵬等[6]研究結(jié)果表明，在0～2 000 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，解淀粉芽孢桿菌均能促進(jìn)小球藻的繁殖。本研究中，蠟樣芽孢桿菌在104～108cfu·mL-1范圍內(nèi)，均不同程度促進(jìn)小球藻的繁殖，這與以上兩位學(xué)者研究結(jié)果相似。王善龍等[26]分離的蠟樣芽孢桿菌菌株可有效抑制綠色顫藻的生長，為波吉卵囊藻等綠藻占據(jù)生態(tài)優(yōu)勢提供了有利空間。

大型蚤具有繁殖快、敏感性高等特點(diǎn)，廣泛用于藥物篩選及生態(tài)環(huán)境評價(jià)[27]。斑馬魚作為模式動(dòng)物，有關(guān)其生態(tài)毒性及藥物評價(jià)有諸多報(bào)道[28]。研究結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌濃度在108cfu·mL-1以下時(shí)，蠟樣芽孢桿菌對大型蚤和斑馬魚均未產(chǎn)生毒害。蠟樣芽孢桿菌濃度在108cfu·mL-1以下時(shí)，未對對蝦產(chǎn)生毒害。草魚灌喂蠟樣芽孢桿菌1012cfu·kg-1，未產(chǎn)生毒害作用。

隨著國家對抗生素使用的限制，微生態(tài)制劑作為綠色投入品被水產(chǎn)業(yè)視為未來發(fā)展方向。學(xué)者們往往關(guān)注菌種的篩選和菌株的功能作用，對水產(chǎn)微生態(tài)制劑尤其是潑灑使用造成的生態(tài)安全關(guān)注較少。本研究選擇蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行生態(tài)學(xué)評價(jià)，不僅僅是為了探討其產(chǎn)業(yè)化的可行性，還因?yàn)樵摼卺t(yī)藥、畜禽上的廣泛應(yīng)用，且有攜帶毒力的風(fēng)險(xiǎn)，故對其生態(tài)安全性進(jìn)行評價(jià)更具有典型性。