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    慢病毒介導(dǎo)IGF—1基因修飾肌源性干細(xì)胞移植治療雌性壓力性尿失禁大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

    2018-09-26 03:24:34陳春經(jīng)
    中外醫(yī)學(xué)研究 2018年14期
    關(guān)鍵詞:基因修飾括約肌存活

    陳春經(jīng)

    【摘要】 目的:探討IGF-1基因修飾的肌源性干細(xì)胞(MDSCs)移植治療雌性壓力性尿失禁大鼠的作用及可能機(jī)制。方法:尿失禁大鼠隨機(jī)分對(duì)照組即MDSCs移植組(n=15)和治療組即IGF-1基因修飾的MDSCs移植組(n=15),以1×106個(gè)MDSCs/只注入尿道距膀胱約0.5 cm處,評(píng)價(jià)注射后尿道閉合功能情況、VEGF的表達(dá)情況及移植細(xì)胞存活情況。結(jié)果:與對(duì)照組比較,治療組膀胱最大容量及腹壓漏尿點(diǎn)壓(ALPP)均升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);細(xì)胞存活數(shù)、VEGF蛋白表達(dá)量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:IGF-1基因修飾的MDSCs增強(qiáng)了其在移植環(huán)境中的生存能力,并通過(guò)其旁分泌功能,可能為治療壓力性尿失禁提供了一種新的方法。

    【關(guān)鍵詞】:胰島素樣生長(zhǎng)因子-1; 肌源性干細(xì)胞; 壓力性尿失禁; 生存能力

    doi:10.14033/j.cnki.cfmr.2018.14.073 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805(2018)14-0-03

    Therapeutic Efficacy of Lentiviral Vector Mediated IGF-1 Gene-Modified Muscle-Derived Stem Cells in Rats with Female Stress Urinary Incontinence/CHEN Chunjing.//Chinese and Foreign Medical Research,2018,16(14):170-172

    【Abstract】 Objective:To explore that whether muscle-derived stem cells(MDSCs) pretreated with IGF-1 could promote urethral sphincter restoration in pudendal nerve-transected rat model.Method:Rats with Female Stress Urinary Incontinence were randomly divided into IGF-1/MDSCs injection group(the experimental group,n=15) and MDSCs injection group(the control group,n=15).MDSCs survival,urethral resistance function,western blot were carried out.Result:Compared with the control group,the maximum capacity of the bladder and abdominal leak point pressure(ALPP) were all increased(P>0.05),and the number of cells survival and expression of VEGF protein were increased significantly in the experimental group(P<0.05).Conclusion:MDSCs pretreated with IGF-1 that enhance their viability in the transplant environment and through their paracrine function may provide a new way to treat stress urinary incontinence.

    【Key words】 IGF-1; Muscle-derived stem cell; Stress urinary incontinence; Viability

    First-authors address:Sanming First Hospital Affiliated to Fujian Medical University,Sanming 365000,China

    全球約有2億多尿失禁患者,其中女性是男性的2~3倍,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。且隨著年齡的增長(zhǎng),發(fā)病率顯著上升,其中壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)是最常見(jiàn)的類(lèi)型[1]。其發(fā)病機(jī)制主要包括尿道高活動(dòng)性和尿道固有括約肌功能障礙(intrinsic sphincter deficiency,ISD)[2]。老年女性SUI患者,幾乎均合并存在ISD[3],現(xiàn)有的治療方法尚不能完全解決伴有ISD的SUI患者的尿道括約肌閉合功能問(wèn)題。因此,迫切需要從本質(zhì)上尋求一種方法以改善尿道括約肌結(jié)構(gòu)和功能缺陷。肌源性干細(xì)胞移植可以修復(fù)和改善骨骼肌功能[4-5],尿道橫紋肌與骨骼肌同源,因此,肌源性干細(xì)胞移植也成為伴有ISD的SUI的一個(gè)研究熱點(diǎn)。而隨著年齡的增長(zhǎng),機(jī)體局部缺血缺氧、氧化應(yīng)激等不利因素均可導(dǎo)致植入的干細(xì)胞存活率下降,進(jìn)而影響細(xì)胞移植的治療效果,因此,如何改善移植微環(huán)境、促進(jìn)移植干細(xì)胞的存活,是首要解決的問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合外源性生長(zhǎng)因子如FGF、HGF、PDGF等可以改善移植微環(huán)境,有利于植入到體內(nèi)干細(xì)胞的定植、生長(zhǎng)和分化[6]。簽于此,本研究探討IGF-1基因修飾的MDSCs移植治療雌性SUI大鼠的作用及可能機(jī)制,旨在尋求一種最佳治療SUI的方案。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料

    取近交系健康未孕雌性Wistar大鼠30只,3~4周齡,級(jí)別為SPF級(jí),合格證號(hào):SCXK(滬)。隨機(jī)分為兩組:MDSCs組(對(duì)照組)和IGF1/MDSCs組(治療組),每組15只,其次每組按術(shù)后1周、2周、4周再均分為3個(gè)亞組,每個(gè)亞組5只。激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss,LCSM510),尿動(dòng)力儀(加拿大Labrie)。

    1.2 方法

    1.2.1 大鼠SUI模型建立 以雙側(cè)陰部神經(jīng)切斷(Pudendal Nerve-Transected,PNT)的方法[7],制備大鼠SUI模型。(1)麻醉、固定、備皮、術(shù)區(qū)消毒;(2)取背側(cè)縱形切口,手術(shù)顯微鏡下找到相對(duì)粗大的坐骨神經(jīng);(3)沿坐骨神經(jīng)走行,在其進(jìn)入閉孔發(fā)出分叉處找到陰部神經(jīng);(4)切斷雙側(cè)陰部神經(jīng)約2 mm;(5)縫合切口;(6)備行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 MDSCs注射治療SUI大鼠模型 各組在距膀胱約0.5 cm處尿道近端的3、9點(diǎn)處進(jìn)針注射含有約1×106個(gè)MDSCs和IGF1/MDSCs懸液,使局部隆起,注射細(xì)胞后留針約10 s,后緩慢出針。

    1.2.3 尿動(dòng)力學(xué)檢查注射后各組大鼠尿控功能 所有大鼠分別于注射后1、2、4周行最大膀胱容量及腹壓漏尿點(diǎn)壓(Abdominal Leak Point Pressure,ALPP)檢測(cè)。(1)行尿動(dòng)力學(xué)檢查前的準(zhǔn)備工作;(2)麻醉、固定、暴露膀胱,于膀胱頂部做荷包縫合,荷包中央植入軟質(zhì)硬膜外麻醉導(dǎo)管,另端經(jīng)皮下隧道固定于大鼠頸背部;(3)檢測(cè)時(shí)于頸部導(dǎo)管埋藏處將導(dǎo)管挑出,插入一號(hào)注射針頭,經(jīng)三通管分別連接灌注泵和壓力傳感器;(4)人工排空膀胱并校零后,以5 ml/h的速度灌注含美蘭的無(wú)菌生理鹽水觀察膀胱壓力上升情況;一旦尿道口有藍(lán)色液體溢出,停止灌注,記錄此時(shí)膀胱容量即最大膀胱容量。人工排空膀胱并校零后,以同樣速度灌注達(dá)膀胱容量的一半,緩慢地按壓腹部直到出現(xiàn)漏尿,此時(shí)的膀胱峰壓即為ALPP,測(cè)定三次,取平均值。

    1.2.4 多重免疫熒光化學(xué)染色 細(xì)胞注射治療后1周行尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后分別處死各組動(dòng)物,觀察各組細(xì)胞在組織內(nèi)的存活情況。(1)斷頸法處死大鼠,暴露尿道;(2)剪取注射部位約0.5 cm長(zhǎng)度的近端尿道,加入O.C.T冷凍包埋劑,置-80 ℃超低溫冰箱保存;(3)將O.C.T包埋組織使用恒溫冰凍切片機(jī)制成厚約8 μm的冰凍切片;(4)冰丙酮固定10 min后凍存于-20 ℃低溫冰箱,用于多重免疫熒光染色;(5)對(duì)收集的標(biāo)本取三片非連續(xù)的8 μm薄片進(jìn)行多重免疫熒光化學(xué)檢測(cè),每張切片在移植細(xì)胞分布區(qū)隨機(jī)取5個(gè)視野,采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算每個(gè)視野移植細(xì)胞數(shù)(個(gè)/HP),取其平均值作為該標(biāo)本的細(xì)胞數(shù)。

    1.2.5 Western-blot分析VEGF蛋白的表達(dá) 細(xì)胞注射治療后4周行尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后分別處死各組動(dòng)物,觀察各組VEGF蛋白的表達(dá)情況。取0.5 cm注射部位近端尿道,通過(guò)細(xì)胞收集,蛋白提取及測(cè)定,電泳分離,免疫印跡(濕轉(zhuǎn)),免疫顯色,圖像分析,灰度值計(jì)算,以目標(biāo)蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白的積分吸光度值比值表示待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

    1.3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 18.0軟件處理,計(jì)量資料以(x±s)表示,采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)ɑ=0.05,P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 IGF-1基因修飾MDSCs對(duì)大鼠SUI模型尿動(dòng)力學(xué)的影響

    與對(duì)照組(MDSCs組)比較,治療組(IGF1/MDSCs組)在治療1、2、4周后,膀胱最大容量和ALPP均升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1、表2。

    2.2 兩組細(xì)胞存活情況

    在細(xì)胞注射治療1周后,與對(duì)照組(MDSCs組)細(xì)胞存活數(shù)(87.67±1.53)個(gè)/每個(gè)高倍鏡視野比較,治療組(IGF1/MDSCs組)的細(xì)胞存活數(shù)(107.67±2.52)個(gè)/每個(gè)高倍鏡視野顯著高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖1。

    2.3 兩組大鼠近端尿道組織VEGF蛋白表達(dá)

    在細(xì)胞注射治療4周后,與對(duì)照組VEGF蛋白的表達(dá)(0.69±0.02)比較,治療組(0.80±0.03)高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。

    注:A圖為治療組細(xì)胞存活情況(×200),B組為對(duì)照組細(xì)胞存活情況(×200)。

    3 討論

    現(xiàn)有的治療對(duì)伴有ISD的SUI患者充滿(mǎn)挑戰(zhàn),細(xì)胞治療為之提供了一個(gè)可能。研究發(fā)現(xiàn)MDSCs不經(jīng)誘導(dǎo)可以分化為肌細(xì)胞,已成功應(yīng)用于臨床治療SUI[8]。然而,植入的MDSCs由于機(jī)體局部缺血缺氧、氧化應(yīng)激等不利因素致使植入的細(xì)胞存活率下降,進(jìn)而影響細(xì)胞的移植效果?;蛐揎椀募?xì)胞治療可以通過(guò)優(yōu)化移植細(xì)胞微環(huán)境,提高細(xì)胞的活性,進(jìn)而改善細(xì)胞的移植效果[9]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植治療1周后,IGF1/MDSC組細(xì)胞在尿道注射部位分布比較集中,存活率顯著高于MDSC組。提示IGF-1作為一促存活因子,可以?xún)?yōu)化移植微環(huán)境,提高植入MDSCs的存活率,進(jìn)而促進(jìn)MDSCs分化為成肌細(xì)胞,改善尿道括約肌閉合功能[10]。

    骨骼肌損傷后的再生修復(fù)還應(yīng)考慮局部血管的再生化。廣泛的血管網(wǎng)可以促進(jìn)局部血液循環(huán),利于植入細(xì)胞的生存生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞治療4周后,IGF1/MDSC組尿道局部VEGF蛋白表達(dá)量明顯高于MDSC組。提示IGF-1可以促進(jìn)MDSCs分泌VEGF,而VEGF具有促進(jìn)肌細(xì)胞生成及促進(jìn)血管再生的雙重作用,進(jìn)而改善尿道括約肌閉合功能[11]。

    在應(yīng)力狀態(tài)下,具有神經(jīng)支配的尿道括約肌的收縮功能變化可以通過(guò)尿動(dòng)力學(xué)中ALPP反映[12],研究發(fā)現(xiàn)IGF1/MDSC組在治療1、2、4周后ALPP均高于MDSC組,提示IGF-1可能促進(jìn)尿道固有括約肌神經(jīng)再支配,進(jìn)而進(jìn)一步改善尿道括約肌閉合功能。

    IGF-1可以通過(guò)優(yōu)化移植微環(huán)境,促進(jìn)移植細(xì)胞的生存、生長(zhǎng),并通過(guò)其自分泌或旁分泌的形式釋放VEGF,促進(jìn)局部血液循環(huán),共同參與尿道括約肌的成肌修復(fù),進(jìn)而改善尿道括約肌閉合功能,具有潛在治療伴有ISD的SUI作用。

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    (收稿日期:2018-03-19)

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