NEK2在胃癌中的表達及其與化療藥物敏感性之間的關(guān)系

王素芳 鄭繪霞 梁建芳 肖虹

中心體的主要生理學(xué)作用是參與細胞的有絲分裂，是細胞中最為重要的微管系統(tǒng)[1]，中心體及相關(guān)作用原件的異常調(diào)控可導(dǎo)致細胞增殖、分化、有絲分裂等作用失常[2]。NEK2（NIMA related kinases 2）是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶NIMA相關(guān)激酶，屬于中心體蛋白相關(guān)激酶NEK家族成員之一[3]，主要在有絲分裂周期過程的G2/M期發(fā)揮作用[4]。據(jù)報道，NEK2表達上調(diào)可推進有絲分裂進程、觸發(fā)染色質(zhì)分裂，在腫瘤的發(fā)生及進展過程中起關(guān)鍵作用[5]。此外，NEK2的異常表達可能通過ABC蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、AKT信號通路等參與細胞耐藥過程[6]。本研究觀察了胃癌組織中NEK2蛋白的表達情況及其與胃癌的基礎(chǔ)化療藥5-氟尿嘧啶（5-FU）、順鉑藥物敏感性之間的關(guān)系，現(xiàn)將實驗結(jié)果整理報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年8月-2017年3月期間山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院手術(shù)切除的胃癌及癌旁新鮮組織患者60例（癌旁組織要求距腫瘤組織＞5 cm）作為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：初發(fā)、散發(fā)，均無胃癌家族史；術(shù)前均未經(jīng)任何放、化療；術(shù)后經(jīng)病理診斷證實均為胃腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：圍手術(shù)期經(jīng)過放、化療或靶向治療；標(biāo)本的留取可能會影響病理診斷。其中男39例，女21例；年齡38～68歲，平均（52.3±10.5）歲；高分化9例，中分化35例，低分化16例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例；美國癌癥聯(lián)合委員會AJCC胃癌TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期34例，Ⅲ+Ⅳ期26例。所有患者均知曉本次研究并簽署知情同意書，該研究已經(jīng)本院倫理委員會倫理審查通過。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)實驗 組織浸泡于中性福爾馬林液中充分固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，烤片，EDTA高壓熱修復(fù)。NEK2一抗（美國thermo fisher）濃度為1∶200，操作步驟按試劑盒說明書進行。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。判定方法：選取5個具有代表意義的高倍視野，計數(shù)100個細胞[7]。NEK2陽性信號定位于細胞質(zhì)和/或細胞核，評分以染色強度和陽性細胞百分比的乘積表示。染色強度：無著色0分，淺黃色為1分，棕黃色和棕褐色2分。陽性細胞數(shù)：＜10%為0分，10%～50%為1分，＞50%為2分。乘積＜2分為陰性，≥2分為陽性。由兩名病理醫(yī)師共同評分。

1.2.2 蛋白印跡實驗 提取新鮮組織蛋白，BCA試劑盒（上海碧云天）檢測蛋白濃度，按說明書步驟進行。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜（武漢博士德），NEK2一抗（濃度1∶200），GAPDH 一抗（1∶300）4 ℃過夜反應(yīng)，室溫下二抗反應(yīng)1 h，ECL電化學(xué)發(fā)光液（北京索來寶）顯色，凝膠成像儀下曝光顯色，目的蛋白的相對表達量以其與GAPDH的灰度值之比表示。

1.2.3 體外藥敏實驗 電子天平稱取1 g腫瘤新鮮組織，青鏈霉素雙抗液反復(fù)沖洗組織，置于離心管內(nèi)充分剪碎，碾磨呈糊狀，加入消化酶，37 ℃孵箱內(nèi)放置1 h，將組織液緩慢通過200目不銹鋼濾網(wǎng)，收集濾液，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（美國thermo fisher）。細胞計數(shù)板計數(shù)調(diào)整細胞濃度至1×105/mL，接種于96孔板中，37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后更換含藥物的培養(yǎng)基，其中5-FU（生產(chǎn)廠家：西安海欣藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字：H20031272）35.0 μg/mL，順鉑（生產(chǎn)廠家：山東齊魯制藥，國藥準(zhǔn)字：H20023460）4.6 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入5%濃度的MTT（美國sigma）20 μL，孵育4 h后棄去上清液，加入二甲基亞砜（上海生工）150 μL，水平搖床輕搖3 min，設(shè)定酶標(biāo)儀波長490 nm，檢測光密度值A(chǔ)。按照公式：1-試驗孔A均值/對照孔A均值×100%計算抑制率IR，IR≥30%定為敏感，IR＜30% 定為耐藥[8]。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察NEK2在胃癌、癌旁組織及轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的表達情況；NEK2在胃癌組織中的表達與臨床、病理學(xué)因素之間的關(guān)系；胃癌新鮮組織對5-FU、順鉑藥物的敏感性；NEK2的表達與5-FU、順鉑敏感性之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，組間比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NEK2在胃癌及癌旁組織中的表達情況分析 NEK2在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1，圖1A、B。黏膜內(nèi)癌顯示較為明顯的對比：腫瘤細胞呈陽性表達，相鄰的正常固有腺呈陰性表達，見圖1C。轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中腫瘤細胞呈陽性表達，見圖1D。

表1 NEK2在胃癌及癌旁組織中的表達情況分析 例

圖1 NEK2在胃癌、癌旁及轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的表達（IHC×200）注：A癌旁組織中的NEK2陰性表達；B腺癌組織中的NEK2陽性表達；C黏膜內(nèi)癌中的NEK2陽性表達，左側(cè)為癌組織，右側(cè)為正常固有腺；D轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的NEK2陽性表達。

2.2 NEK2在胃癌組織中的表達與臨床、病理學(xué)因素之間的關(guān)系分析 NEK2在胃癌組織中的表達與患者的年齡、性別、腫物大小比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 NEK2在胃癌組織中的表達與臨床、病理學(xué)因素間的關(guān)系 例

2.3 NEK2蛋白相對表達量與5-FU、順鉑敏感性之間的關(guān)系 60例胃癌新鮮組織中去除污染、貼壁不佳及實驗操作等，最終35例原代培養(yǎng)成功。其中，5-FU耐藥22例，耐藥率為62.9%；順鉑耐藥19例，耐藥率為54.3%。5-FU敏感組及耐藥組NEK2蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；順鉑敏感組及耐藥組NEK2蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。NEK2蛋白相對表達量與5-FU的藥物敏感性無顯著關(guān)系（P＞0.05），而順鉑耐藥組NEK2蛋白表達量顯著增高（P＜0.05），見圖 2。

表3 5-FU、順鉑敏感組及耐藥組NEK2蛋白的相對表達量比較（±s）

表3 5-FU、順鉑敏感組及耐藥組NEK2蛋白的相對表達量比較（±s）

類別 敏感組 耐藥組 t值 P值5-FU（n=35） 0.942 0±0.168 8 1.040 4±0.288 9 -0.657 0.529順鉑（n=35） 0.661 0±0.100 5 1.117 0±0.300 4 -3.153 0.014

圖2 NEK2在5-FU及順鉑敏感/耐藥組中的表達注：1、2、3泳道為5-FU敏感組，4、5、6泳道為5-FU耐藥組；a、b、c為順鉑敏感組，d、e、f泳道為順鉑耐藥組。

3 討論

NEK2是1992年Letwin等[9]學(xué)者從小鼠細胞中鑒定出的一種蛋白激酶，人類NEK2基因編碼的蛋白質(zhì)含有445個氨基酸殘基，分子量大小為48 KD，激酶區(qū)域有典型絲/蘇氨酸蛋白激酶的氨基酸序列，在紡錘體組裝監(jiān)控點、中心體分裂、染色體不穩(wěn)定中發(fā)揮重要的作用[10-11]。NEK2在腫瘤中的作用是近年來國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點，現(xiàn)有的報道表明，NEK2在胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌等上皮源性腫瘤[12-14]，以及霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、精原細胞瘤等間葉源性腫瘤中均存在不同程度的表達上調(diào)[15-17]，功能學(xué)研究證實：下調(diào)腫瘤細胞中NEK2的基因表達，可使腫瘤細胞增殖活性降低、周期受阻、凋亡增加，有望成為腫瘤靶向治療的候選基因。本研究結(jié)果表明，與癌旁正常組織相比，NEK2在胃癌組織中的表達顯著上調(diào)，提示胃癌組織中中心體蛋白相關(guān)激酶通路可能出于失調(diào)控狀態(tài)，NEK2可能參與了胃癌的發(fā)生過程。在胃癌組織中，NEK2的表達與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)，說明NEK2可能與胃癌的惡性程度及預(yù)后有關(guān)。

腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性是常規(guī)化療藥物及靶向藥物在臨床應(yīng)用時治療終止或失敗的主要原因，據(jù)報道：當(dāng)NEK2基因表達上調(diào)時，腫瘤細胞將化療藥物由細胞內(nèi)泵出細胞外的活性增加，NEK2活性增加可導(dǎo)致ABC蛋白轉(zhuǎn)運家族各成員表達上調(diào)[18]，抑制AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中PP1的活性[19]，從而導(dǎo)致腫瘤細胞耐藥。對乳腺癌細胞耐藥機制的研究中發(fā)現(xiàn)：NEK2干擾siRNA可以增加癌細胞對化療藥物的敏感性[20]。沉默NEK2基因的表達可以提高肺癌耐藥細胞株對阿霉素、順鉑等藥物的敏感性，NEK2有望成為逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥的一個新的基因靶點[21]。本研究采用體外藥敏實驗，檢測了胃癌細胞對常規(guī)化療藥物5-FU及順鉑的敏感性，結(jié)果表明5-FU耐藥率為62.9%，順鉑耐藥率為54.3%，按照癌細胞對不同化療藥體外的抑制率，筆者將其分為敏感和耐藥兩組，NEK2與5-FU的藥物敏感性無顯著關(guān)系，而順鉑耐藥組NEK2蛋白的表達量顯著增高，說明胃癌中NEK2的表達可能與鉑類藥物的耐藥性有關(guān)。

綜上所述，NEK2在胃癌組織中表達上調(diào)，與腫瘤的進展程度及順鉑耐藥有關(guān)，有望成為胃癌診斷、預(yù)后及治療新的分子靶點，由于中心體相關(guān)蛋白激酶及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)龐大且復(fù)雜，NEK2在腫瘤中的具體作用機制尚待進一步研究。