正交設(shè)計(jì)優(yōu)選甘草多糖的提取工藝

劉永嶺 王艷艷

摘要：本文主要對(duì)甘草多糖的提取工藝進(jìn)行研究。對(duì)影響甘草多糖提取的影響因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)研究，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，最后得出提取溫度90℃，提取時(shí)間2小時(shí)，料液比1：20提取效果為最佳。

Abstract： This article mainly studys on the extraction of Glycyrrhiza polysaccharide. Influencing factor of effect of extracting Glycyrrhiza polysaccharide is the temperature of extracting， the time of extracting， the amount of dissolvent. To choice the best condition of the extraction of Glycyrrhiza polysaccharide， we contrive single factor and orthogonal experiments，conclusion： the temperature of extracting is 90℃， the time of extracting is 2h， the amount of dissolvent is 20 times，which is the best condition.

關(guān)鍵詞： 甘草多糖；蒽酮-硫酸法；正交設(shè)計(jì)；提取工藝

Key words： glycyrrhiza polysaccharide；anthrone and sulfuric acid method；orthogonal design；extract technology

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-4311（2018）26-0249-03

0 引言

大量的研究已證實(shí)，植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，如有報(bào)道證明甘草多糖溶于水，能夠直接作用于人體免疫系統(tǒng)，活化休眠的免疫細(xì)胞，使其分泌出更多的免疫因子，從而增強(qiáng)人體抗病能力，同時(shí)，還具有抗炎、抗病毒、抗衰老以及修復(fù)自身免疫性疾病的功效。此外還有報(bào)道證明甘草多糖也具有多種免疫增強(qiáng)功能，能激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，具有抗、補(bǔ)體活性，直接刺激B淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)人體中IgM、IgG的產(chǎn)生，還能誘生和促誘生干擾素，增強(qiáng)機(jī)體的殺傷細(xì)胞活性[1]。甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflataBat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabraL.）的干燥根及根莖，為多年生草本植物。喜生于沙灘、草原，主產(chǎn)于新疆、內(nèi)蒙、山西、甘肅等地，是傳統(tǒng)常用中草藥之一[2]，俗稱“眾藥之王”，入藥已有悠久歷史。

甘草的主要活性成分為甘草黃酮類和甘草皂苷類成分。其中黃酮類成分主要有甘草苷、異甘草苷、甘草素和異甘草素等，甘草皂苷類成分主要為甘草酸、甘草多糖、甘草皂苷G2和烏拉爾甘草皂苷B等[3]。黃酮類主要溶于有機(jī)溶劑不溶于水，甘草多糖溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，利用這兩點(diǎn)性質(zhì)，就可以設(shè)計(jì)在概的提取工藝，即先醇提，再水提。然后根據(jù)國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者對(duì)甘草多糖研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用水煮法從粉碎的甘草根中提取水溶性甘草多糖，通過對(duì)所提甘草多糖的得率及浸膏得率進(jìn)行比較，從而篩選出甘草多糖更為簡(jiǎn)單高效的提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

蒽酮、乙醇、薄層層析硅膠（100-140目）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；UV-9600型紫外-可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵旋蒸（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）； ZF 超聲波清洗機(jī)（上海致豐電子科技有限公司）；LD5-2A型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蒽酮溶液的配制：（現(xiàn)配現(xiàn)用）精密稱取50.00mg蒽酮用76%稀H2SO4（76ml濃H2SO4加30ml水中）定容到50ml。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取105℃干燥恒重的葡萄糖25.00mg，加蒸餾水25ml，配成1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別量取標(biāo)準(zhǔn)液0.5，1.0，1.5，2.0， 2.5，3.0ml于25ml容量瓶中，分別加蒸餾水定容搖勻，再分別吸取不同濃度的葡萄糖溶液各1ml，加5ml蒽酮試液，放入冰水浴中搖勻后，置沸水浴中煮10min，取出用水沖洗2min 冷卻，靜置10min后于624nm 處開始測(cè)定吸光度，以蒸餾水1.0ml 同上作空白對(duì)照。

以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作回歸處理，得回歸方程為y = 0.0047x + 0.0325 R2 = 0.9982 葡萄糖在20～120μg/ml 范圍內(nèi)吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

①醇提?。悍謩e稱取10.00g甘草粉末（用粉碎機(jī)粉碎過40目篩），用80%的乙醇按1：5的量分別提取兩次，每次1小時(shí)，抽濾，得藥渣，備用。

②水提?。簩⑸鲜鏊盟幵磫我蛩貙?shí)驗(yàn)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

③測(cè)定A：將所得的濾液定容到500ml，再稀釋25倍，用繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行測(cè)量吸光度。

④浸膏：取定容到500ml 的濾液50ml 在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行濃縮，再放入恒溫干燥箱里干燥，冷卻后稱其質(zhì)量為M2。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

①提取時(shí)間的影響

注：浸膏得率（%）=[（m2-m1）*500ml/（50ml*10g）]*100% （1）

注：提取率（%）=（A-0.0325）/0.0047*1000*25*500/10000*100% （2）

②提取溫度的影響（圖3、圖4）

③料液比的影響（圖5、圖6）

2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

提取時(shí)間對(duì)甘草多糖提取得率的影響如圖1所示，在2.0h前提取率隨時(shí)間的增加而增加，到2.5h開始減少，即2.0h時(shí)達(dá)到最大。提取溫度對(duì)甘草多糖提取得率的影響如圖2所示，在60～90℃，提取率隨溫度的增加而上升，90℃后就有所下降。料液比對(duì)甘草多糖提取得率的影響如圖5所示，提取率隨料液比的增大而增加，但在1：30以后增加的趨勢(shì)減緩。

綜上所述，再考慮生產(chǎn)成本和工藝等條件，可選取表2按L9（34）正交表做實(shí)驗(yàn)。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述的因素表可得到如下的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表3。

根據(jù)上述的正交實(shí)驗(yàn)方案表做實(shí)驗(yàn)，可得到如表4和表5結(jié)果。

甘草多糖提取條件正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。根據(jù)極差分析結(jié)果可知，各種因素對(duì)提取效果的影響順序?yàn)椋篈>C>B；最佳水平組合為：A3B2C1，即最佳工藝條件為反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時(shí)間2.0小時(shí)，料液比1：20，可得提取率和浸膏得率最高。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取10.00g甘草粉末用1：5的80%乙醇分別提取兩次，每次1小時(shí)，抽濾，得濾渣，再用1：20的蒸溜水量，在90℃下，提取2小時(shí)。最后抽濾得濾液，定容到500ml的容量瓶中，再稀釋25倍，按做標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)其吸光度為0.315，并計(jì)算提取率為7.51%，浸膏得率為12.45%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)得到相應(yīng)的條件對(duì)甘草多糖提取率和浸膏得率的影響，即提取時(shí)間對(duì)提取率和浸膏得率的影響，在0.5～2.0h之間是隨時(shí)間的增加而提高，但在2.0h后就隨時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯降低；提取溫度對(duì)提取率和浸膏得率的影響，在60～90℃之間是隨溫度的升高而增加，在90℃后就減少了；料液比對(duì)提取率和浸膏得率的影響，它們都隨溶劑的增加而增加，但在1：30時(shí)增加的趨勢(shì)開始減緩，所以我們選取了提取時(shí)間1.5、2.0、2.5，提取溫度70℃、80℃、90℃，料液比1：20、1：25、1：30，這三個(gè)水平做為正交實(shí)驗(yàn)因素水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。把正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，可知在反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時(shí)間2.0小時(shí)，料液比1：20條件下提取甘草多糖可以得到較高的提取率和浸膏得率。且為了提取多糖純品，用80%乙醉處理藥材，以除去單糖、低聚糖、苷類及生物堿等干擾性成分，用水提取其中的多糖。

參考文獻(xiàn)：

[1]董永軍，王麗榮，王憲文，李園園，杭柏林，梁美蘭，馬要峰.甘草多糖的提取及其對(duì)肉仔雞免疫功能的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008（5）：692.

[2]孫萍，李艷，顧承志，陳宏偉.甘草多糖的微波提取及含量測(cè)定[J].基層中藥雜志，2001（6）：22.

[3]李偉，王躍飛，文紅梅，崔小兵，趙曉莉.HPLC-DAD同時(shí)分析甘草中7種有效成分[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2008（24）：1914.