露地菊腳芽農(nóng)桿菌真空滲透轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的建立

王羽晗 李子豪 李世彪 陳馳航 王瑜麟 吳雅妮 張旸

摘要：【目的】建立露地菊腳芽農(nóng)桿菌真空滲透轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，為菊花品質(zhì)改良提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎棉r(nóng)桿菌真空滲透和浸染轉(zhuǎn)化法對露地菊火焰的腳芽進行目的基因遺傳轉(zhuǎn)化，分析其PCR結(jié)果，以抗性分化苗葉片進行β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）組織染色驗證轉(zhuǎn)基因植株，分析農(nóng)桿菌真空滲透轉(zhuǎn)化率。【結(jié)果】將含AtLFY基因和AtCO基因的表達載體分別轉(zhuǎn)入露地菊根部腳芽中，通過PCR檢測GUS染色鑒定后，真空滲透1次的平均轉(zhuǎn)化率為11.97%，真空滲透2次的平均轉(zhuǎn)化率為15.86%，菌液浸染10 min的平均轉(zhuǎn)化率為3.64%，菌液浸染20 min的平均轉(zhuǎn)化率為11.14%，總體嵌合率為14.58%?！窘Y(jié)論】建立的露地菊腳芽農(nóng)桿菌真空滲透轉(zhuǎn)化技術(shù)體系對露地菊的遺傳轉(zhuǎn)化效率高，可操作性強。

關(guān)鍵詞： 露地菊;農(nóng)桿菌;真空滲透轉(zhuǎn)化技術(shù);浸染;腳芽;遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號： S682.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）11-2236-06

Establishment of vacuum infiltration and transformation technique of Agrobacterium in Chrysanthemum morifolium

foot buds

WANG Yu-han， LI Zi-hao， LI Shi-biao， CHEN Chi-hang， WANG Yu-lin，

WU Ya-ni， ZHANG Yang*

（College of Life Science， Northeast Forestry University， Harbin? 150040， China）

Abstract：【Objective】The objective of this study was to establish a vacuum infiltration transformation technology system of Agrobacterium in Chrysanthemum morifolium foot buds in open field and provide reference for improving the quality of Chrysanthemum. 【Method】Target genes of C. morifolium Flame foot buds were genetically transformed by Agrobacterium infiltration and transformation，and the results of PCR were analyzed. Gus-stained leaves of resistance differen-tiation seedlings were used to verify transgenic plants， and Agrobacterium transformation rate under vacuum infiltration was studied. 【Result】The expression vectors containing AtLFY and AtCO genes were respectively transferred into the foot buds of C. morifolium. After being identified by PCR and β-glucuronidase（GUS） staining， the transformation rate of va-cuum infiltration for once was 11.97% on average，transformation rate of vacuum infiltration for twice was 15.86% on avera-ge. The average transformation rate was 3.64% after 10 min of dipping in bacteria liquid，the average transformation rate was 11.14% after dipping in bacteria liquid for 20 min，and the overall chimerism rate was 14.58%. 【Conclusion】Therefore，the established Agrobacterium vacuum infiltration and transformation method for C. morifolium is with high genetic transformation efficiency and strong operability.

Key words： Chrysanthemum morifolium; Agrobacterium; vacuum infiltration and transformation; dipping; foot shoot; genetic transformation

0 引言

【研究意義】露地菊（Chrysanthemum morifolium）是菊科菊屬多年生草本植物，其株型矮壯，具有抗寒、抗旱、抗瘠薄、抗病蟲、開花繁盛和管理粗放等特點，在園林綠化和觀光園區(qū)布景中占有重要地位。為了提高露地菊的觀賞品質(zhì)，通常采用轉(zhuǎn)基因方法對其花色、花期、花型和抗性等進行改良。菊花的遺傳轉(zhuǎn)化多以葉片、花梗、莖段為外植體材料進行農(nóng)桿菌浸染，也有研究嘗試使用花瓣、子房、葉柄、葉軸、愈傷組織和原生質(zhì)體等作為農(nóng)桿菌浸染的外植體（李辛雷等，2004;毛洪玉等，2005;任永霞等，2005;于利剛等，2011;張志玲等，2011）。目前對菊花進行遺傳轉(zhuǎn)化通常采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤轉(zhuǎn)化法，存在操作復(fù)雜、轉(zhuǎn)化周期長及轉(zhuǎn)化率低等缺點（佟玲，2012），且需進行大量的組織培養(yǎng)試驗才能得到完整的轉(zhuǎn)基因植株。因此，建立露地菊腳芽農(nóng)桿菌真空滲透轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，對改良菊花品質(zhì)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Tosca等（2000）、Shinoyama等（2002）、蔣細旺和包滿珠（2003）利用玉米AC/DS轉(zhuǎn)座系統(tǒng)研究菊花轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AC/DS周圍基因標簽系統(tǒng)成功插在活性位點上，轉(zhuǎn)化頻率達7.8%，遠高于一般研究的轉(zhuǎn)化頻率（3.0%～5.2%）。劉軍等（2004）研究表明，用無菌濾紙浸蘸MS培養(yǎng)基覆蓋在接種菊花葉盤上，可提高其葉盤轉(zhuǎn)化率。張燕紅等（2008）利用農(nóng)桿菌真空滲透轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化棉花花粉，發(fā)現(xiàn)當真空滲透轉(zhuǎn)化時間維持15～25 min時，可降低花粉的破損率和提高瞬時轉(zhuǎn)化效率。陳天子（2009）研究認為，通過農(nóng)桿菌浸蘸棉花花柱進行整株活體轉(zhuǎn)化可提高棉花遺傳轉(zhuǎn)化率。唐宜等（2017）以非洲菊舌狀花花瓣為材料，利用農(nóng)桿菌真空滲透法成功建立了花瓣瞬時表達系統(tǒng)?！颈狙芯壳腥朦c】真空滲透法和浸染法是非組培法，但目前利用真空滲透法和浸染法進行菊花腳芽轉(zhuǎn)基因操作的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選用露地菊品種火焰的腳芽為受體，通過真空滲透和浸染法將構(gòu)建的pCAMBIA1301-AtCO和pCAMBIA1301-AtLFY質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)入其中，誘導(dǎo)其開花和維持花的正常發(fā)育，建立露地菊腳芽農(nóng)桿菌真空滲透轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，為菊花品質(zhì)改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

選取已成熟露地菊品種火焰種子種植于東北林業(yè)大學(xué)花卉工程研究所苗圃。從苗圃地中選擇其成熟植株，從土壤中挖出根部腳芽，摘取其長約3.0 cm的腳芽用于后續(xù)試驗。pCAMBIA1301-PMI載體中包含一個磷酸甘露糖異構(gòu)酶（Phosphomannose isomerase，PMI）篩選基因和GUS報告基因。目的基因AtLFY（ID：836307）和AtCO（ID：831441）均從擬南芥中克隆獲得，其質(zhì)粒物理圖譜見圖1和圖2。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 農(nóng)桿菌真空滲透和浸染法轉(zhuǎn)化露地菊腳芽

采用真空滲透和浸染法對露地菊腳芽目的基因進行遺傳轉(zhuǎn)化（農(nóng)桿菌濃度OD800為0.4～0.6）。

農(nóng)桿菌真空滲透法（儀器為Heto DRYWINNER）：將摘取的400棵腳芽隨機分為4份，每份100棵，分別用含AtLFY和AtCO目的基因農(nóng)桿菌的LB液體培養(yǎng)基對腳芽進行真空滲透（以150 mL LB液體培養(yǎng)基浸泡100棵腳芽）。設(shè)真空滲透1次（約3 min）和真空滲透2次（約7 min）兩個試驗梯度。以菌液真空滲透沸騰1次為計量標準處理100棵腳芽。真空處理后再恢復(fù)常壓，使農(nóng)桿菌菌液滲入植物組織內(nèi)部。每次處理100棵腳芽，每個梯度2個處理和2個目的基因，總計400棵腳芽。

農(nóng)桿菌浸染法：與真空滲透法一樣，將400棵腳芽隨機分為4份，每份100棵，分別用含AtLFY/AtCO目的基因農(nóng)桿菌的LB液體培養(yǎng)基處理試驗?zāi)_芽（以150 mL LB液體培養(yǎng)基浸染100棵腳芽）。設(shè)菌液浸蘸10 min和菌液浸蘸20 min兩個試驗梯度。每次處理100棵腳芽，每個梯度2個處理和2個目的基因，總計400棵腳芽。

1. 2. 2 轉(zhuǎn)化后腳芽扦插 將轉(zhuǎn)化后的腳芽扦插于沙盆中暗培養(yǎng)1 d，之后按光照/黑暗培養(yǎng)16 h/8 h。待腳芽長至5～6葉進行后續(xù)試驗。

1. 2. 3 轉(zhuǎn)基因植株篩選

1. 2. 3. 1 總DNA提取（CTAB法） 提取步驟：①向1.5 mL EP管中加入700.0 μL 2% CTAB抽提液、15.0 μL β-巰基乙醇，少許PVP;②選取3～4片露地菊的新鮮葉片，在液氮中研磨成粉末后立即轉(zhuǎn)入1.5 mL加有抽提液的離心管中，輕緩搖動混勻;③加入等體積的苯酚/氯仿∶異戊醇（24∶1），混勻，將離心管放入冷凍離心機，4 ℃下12000 r/min離心10 min;④取上清液置于一個新的離心管中，重復(fù)進行③的操作;⑤再取上清液置于一個新的離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇，混勻，將離心管放入冷凍離心機，4 ℃下12000 r/min離心10 min;⑥小心取上清液，加入等體積的異丙醇（提前預(yù)冷），混勻，出現(xiàn)白色絮狀物即為成功提取DNA，冰上靜置30 min;⑦將離心管放入冷凍離心機，4 ℃下12000 r/min離心10 min，棄上清液，加入800.0 μL 75%乙醇清洗沉淀;⑧將離心管放入冷凍離心機，4 ℃，12000 r/min離心10 min，棄上清液，室溫干燥沉淀，加入20.0 μL滅菌去離子水溶解沉淀;⑨取1.5 μL DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將剩余的DNA產(chǎn)物于4 ℃冰箱短期保存，-40 ℃冰箱長期保存。

1. 2. 3. 2 PCR檢測 以經(jīng)PMI基因篩選獲得的露地菊火焰轉(zhuǎn)化植株總DNA為模板，以pCAMBIA1301-PMI質(zhì)粒DNA為陽性對照，野生型露地菊火焰為陰性對照，用生物安全性篩選標記基因PMI的1對特異性引物進行PCR擴增。

設(shè)計引物序列PMI-F：5'-GGGCATCGAGATGC

AAAAACTCATTAACT-3'，PMI-R：5'-ATACTCGAG

CAGCTTGTTGTAAACACGCGCTA-3'，目的片段約1180 bp。PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：DAN（50 ng/μL）模版1.0 μL，PMI-F和PMI-R（10 μL）各0.4 μL，Ex Taq DNA（5 U/μL）聚合酶10.0 μL，ddH2O 8.2 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進行35個循環(huán);72 ℃延伸7 min;10 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離后檢測目標條帶是否出現(xiàn)，并驗證目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化是否轉(zhuǎn)化成功。

1. 2. 3. 3 GUS組織染色檢測 采用GUS染色法進一步驗證轉(zhuǎn)基因植株。取篩選出的抗性分化苗葉片浸泡在GUS染色液中，于37 ℃保溫過夜;將過夜染色后的葉片轉(zhuǎn)入75%乙醇中脫色，直至葉片本身的色素去除干凈;具有GUS活性的部位或位點呈藍色或藍色斑點，肉眼或顯微鏡下觀察可見。

1. 2. 4 轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定 將篩選出的轉(zhuǎn)基因植株移栽到小盆中，與野生型露地菊火焰植株進行表型比較，觀測現(xiàn)蕾時間。

2 結(jié)果與分析

2. 1 真空滲透和浸染法轉(zhuǎn)化露地菊的PCR檢測結(jié)果

露地菊火焰腳芽經(jīng)兩種非組培法遺傳轉(zhuǎn)化處理后進行扦插繁殖，45 d后取新鮮葉片進行初步PCR檢測。從圖3可看出，1～6泳道均出現(xiàn)清晰的目的條帶，從圖4可看出，2、3、5、9、10、11、12、14、16和20泳道均出現(xiàn)清晰的目的條帶，說明已成功克隆出目的基因。

對上述轉(zhuǎn)入AtCO和AtLFY基因植株的PCR擴增結(jié)果進行歸納分析后，統(tǒng)計真空滲透1次和2次及菌液浸染10和20 min的目的基因轉(zhuǎn)化率。由表1和表2可知，真空滲透和浸染法均能獲得露地菊轉(zhuǎn)基因植株，其中真空滲透1次的平均轉(zhuǎn)化率為11.97%，真空滲透2次的平均轉(zhuǎn)化率為15.86%，菌液浸染10 min的平均轉(zhuǎn)化率為3.64%，菌液浸染20 min的平均轉(zhuǎn)化率為11.14%。說明真空滲透法的平均轉(zhuǎn)化率和菌液浸染法的平均轉(zhuǎn)化率均優(yōu)于常規(guī)轉(zhuǎn)化方法（2.00%～6.00%）。

2. 2 轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色結(jié)果

為了進一步驗證露地菊火焰轉(zhuǎn)基因植株的真假，在其成花過程的現(xiàn)蕾期剪取花蕾附近的幼嫩葉片進行GUS染色（圖5），發(fā)現(xiàn)58棵轉(zhuǎn)基因植株中有10株自然死亡，20株染色（藍色）明顯，21株僅葉尖和葉片邊緣染色，7株未染色，嵌合率為14.58%。說明真空滲透和菌液浸染法獲得的轉(zhuǎn)基因植株存在假陽性植株。

2. 3 轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察

通過PCR鑒定和GUS染色等分子生物學(xué)鑒定，將從轉(zhuǎn)化植株中篩選出的轉(zhuǎn)基因植株與野生型露地菊火焰同時移至小盆中種植，自然光周期培養(yǎng)，進行表型觀察，比較轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株花期（以整個株系顯露50%花蕾為標準）的差異。從圖6可看出，野生型植株未現(xiàn)蕾，而轉(zhuǎn)基因植株提前1個月現(xiàn)蕾，說明露地菊的轉(zhuǎn)基因效果明顯，且可通過表型觀察出來。

3 討論

假陽性轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)生可能是PCR過程所引起。吳建祥等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，以木糖和甘露糖對植物細胞進行毒害作用能有效降低假陽性芽產(chǎn)生，通過木糖和甘露糖對轉(zhuǎn)基因植株進行篩選后可降低假陽性芽產(chǎn)生的概率。本研究中，在露地菊火焰目的基因轉(zhuǎn)化植株繁殖至現(xiàn)蕾期時對其花蕾附近的葉片進行GUS染色驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)58棵轉(zhuǎn)基因植株中有7棵植株未染出藍色，表明在目的基因轉(zhuǎn)化植株中已出現(xiàn)了假陽性植株或嵌合體。因此認為，木糖和甘露糖更適合作為菊花轉(zhuǎn)基因篩選劑。

雷建峰等（2016）的研究結(jié)果表明，農(nóng)桿菌真空轉(zhuǎn)化與不抽真空轉(zhuǎn)化棉花花粉的轉(zhuǎn)化效率存在差異，且以真空轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率明顯高于不抽真空的轉(zhuǎn)化率。本研究結(jié)果與其相似，露地菊腳芽的真空轉(zhuǎn)化率高，可獲得較多的轉(zhuǎn)化植株，但因再生植株無性系變異明顯，轉(zhuǎn)化的外源基因穩(wěn)定性差，嵌合體多，導(dǎo)致試驗中兩種非組培轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化露地菊的轉(zhuǎn)化率不穩(wěn)定。

馮連榮等（2015）研究證實，農(nóng)桿菌在培養(yǎng)基及材料表面過度增殖時，外植體會受到毒害，農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率也受到影響。由于露地菊火焰腳芽及受傷的細胞容易受到病毒或質(zhì)粒感染，這些病毒或質(zhì)粒上的某些DNA通過不同方式轉(zhuǎn)移到受傷的植物細胞并形成愈傷組織，因此，愈傷組織可培養(yǎng)成完整的轉(zhuǎn)化植株，正常的轉(zhuǎn)化效率會受到影響。

本研究結(jié)果表明，農(nóng)桿菌真空滲透法對露地菊的轉(zhuǎn)化率優(yōu)于浸染法，二者均優(yōu)于傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（轉(zhuǎn)化效率一般為2.00%～6.00%）的轉(zhuǎn)化效率。

4 結(jié)論

本研究成功建立了露地菊火焰腳芽農(nóng)桿菌真空滲透轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，對露地菊的遺傳轉(zhuǎn)化效率高，可操作性強，可供菊花品質(zhì)改良參考。

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