Box—Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化蓽茇總生物堿的提取工藝研究

楊家強(qiáng) 車萬(wàn)莉 彭紅艷 王維

中圖分類號(hào) R283 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）13-1802-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.18

摘 要 目的：優(yōu)化蓽茇總生物堿的提取工藝，為蓽茇的深入開(kāi)發(fā)和綜合利用提供參考。方法：以總生物堿（指標(biāo)性成分為胡椒堿）的提取率為考察指標(biāo)，藥材粉碎度、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，采用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化蓽茇總生物堿的提取工藝，并進(jìn)行3次（蓽茇用量分別為1.00、10.00、100.00 g）驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為粉碎度90目，加入32倍量的無(wú)水乙醇提取3次，每次提取170 min。最優(yōu)工藝條件下，在蓽茇用量為1.00、10.00、100.00 g時(shí)蓽茇總生物堿的提取率分別為5.015、5.028、5.041 mg/g，與預(yù)測(cè)值5.025 mg/g的相對(duì)誤差分別為0.20%、0.06%、0.26%，差異較小。結(jié)論：本研究?jī)?yōu)選的蓽茇總生物堿的提取工藝合理、穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 蓽茇；總生物堿；Box-Behnken響應(yīng)面法；提取率；提取工藝

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of total alkaloids from Piper longum， and to provide reference for deep development and comprehensive utilization of P. longum. METHODS： With the extraction rates of total alkaloids （the target component for piperine） as reference index， using comminution degree of medicinal materials， liquid-solid ratio， extraction time and extraction times as factors， single factor test and Box-Behnken response surface methodology were adopted to optimize the extraction technology of total alkaloids from P. longum. The validation tests were conducted for 3 times （the amounts of P. longum were 1.00， 10.00， 100.00 g）. RESULTS： The optimal extraction technology was that comminution degree of 90 mesh， 32-fold absolute ethanol， extracting for 3 times， lasting for 170 min each time. Under optimal technology， the extraction rates of total alkaloids from P. longum were 5.015， 5.028， 5.041 mg/g when the amount of P. longum were 1.00， 10.00， 100.00 g； relative errors of them to predicted value 5.025 mg/g were 0.20%， 0.06%， 0.26%， respectively. There was small difference. CONCLUSIONS： The optimal extraction technology of total alkaloids of P. longum is reasonable， stable and feasible.

KEYWORDS Piper longum； Total alkaloids； Box-Behnken response surface methodology； Extraction rate； Extraction technology

蓽茇為胡椒科植物蓽茇（Piper longum L.）的干燥近成熟或成熟果穗，味辛、熱，具有溫中散寒、下氣止痛之功效，用于脘腹冷痛、嘔吐、寒凝氣滯、胸痹心痛、頭痛、牙痛等[1]?，F(xiàn)代研究表明，蓽茇具有抗氧化、抗血小板集聚、抗高血脂和抗菌等多種作用[2-4]。蓽茇中生物堿種類較多、含量高，具有多種生物活性，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用均較廣泛[5]。研究顯示，蓽茇總生物堿對(duì)多種實(shí)體腫瘤和血液病均有抑制作用，具有很好的清除自由基能力[6]；對(duì)6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的帕金森病模型大鼠的黑質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)作用[7]；此外，還具有殺蟲(chóng)、殺螨作用[8]等。Box-Behnken響應(yīng)面法是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，已被廣泛地用于多因素的試驗(yàn)優(yōu)化[9-10]。本研究擬采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化蓽茇總生物堿的提取工藝，為蓽茇的質(zhì)量控制以及對(duì)其深入開(kāi)發(fā)和綜合利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BS224S電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；510酸度計(jì)（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）；XS-04B多功能粉碎機(jī)（東莞市隆鑫機(jī)電設(shè)備有限公司）；TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 藥材、對(duì)照品與試劑

蓽茇藥材（遵義中藥材公司，批號(hào)：160056，由遵義醫(yī)學(xué)院楊建文主任藥師鑒定為真品）；胡椒堿對(duì)照品（上海雅吉生物科技有限公司，批號(hào)：16041311，純度：99.99%）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蓽茇總生物堿的提取

取蓽茇藥材切成小段，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩，取一定量的粉末，置于圓底燒瓶中，再加入無(wú)水乙醇，加熱回流提取，過(guò)濾，合并濾液，濃縮，收集備用。

2.2 蓽茇總生物堿的含量測(cè)定

采用酸性染料比色法[11]測(cè)定蓽茇總生物堿的含量。精密稱取0.010 0 g胡椒堿對(duì)照品，置于25 mL棕色量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。取適量上述溶液，再用無(wú)水乙醇分別稀釋制成質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/L的對(duì)照品溶液。精密量取0.5 mL上述各對(duì)照品溶液，置于6個(gè)分液漏斗中，分別加入6.0 mL溴百里香酚藍(lán)溶液和pH 6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液4.0 mL，搖勻；加入20 mL二氯甲烷，振搖，靜置30 min。然后在418 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=49.694x-0.021 3（r2=0.999 2），結(jié)果表明，胡椒堿質(zhì)量濃度在0.053～20.65 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蓽茇總生物堿的提取率：總生物堿提取率=CV1V2/V3W×100%（C=測(cè)量液總生物堿的濃度；V1=測(cè)量液定容的體積；V2=提取液定容的體積；V3=測(cè)量時(shí)量取的體積；W=樣品的質(zhì)量）。

2.3 單因素試驗(yàn)考察

在對(duì)中藥材生物堿提取的過(guò)程中，藥材粉碎度、溶劑種類、提取的料液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)等因素對(duì)提取率有著重要影響[12-13]。因此，在本工藝優(yōu)化試驗(yàn)中，筆者選擇如下因素進(jìn)行考察。

2.3.1 藥材粉碎度 取蓽茇粉末，過(guò)20、40、60、80、100目標(biāo)準(zhǔn)篩，分別精密稱取不同粉碎度樣品1.00 g，置于圓底燒瓶中，在室溫下用10倍量體積的無(wú)水乙醇浸提2 h，計(jì)算出不同粉碎度樣品中總生物堿的提取率。結(jié)果顯示，過(guò)20、40、60、80、100目標(biāo)準(zhǔn)篩樣品中蓽茇總生物堿的提取率分別為2.92、3.12、3.21、3.30、3.22 mg/g，故確定80目蓽茇細(xì)粉為最優(yōu)提取粉碎度。

2.3.2 液料比 精密稱取6份蓽茇細(xì)粉（過(guò)80目標(biāo)準(zhǔn)篩），每份1.00 g，分別置于圓底燒瓶中，依次加入10、20、30、40、50、60倍量的無(wú)水乙醇，浸潤(rùn)30 min后，加熱回流提取2 h，計(jì)算不同液料比下樣品總生物堿的提取率。結(jié)果顯示，加入10、20、30、40、50、60倍量的無(wú)水乙醇提取后蓽茇總生物堿的提取率分別為3.30、3.41、3.59、3.43、3.42、3.31 mg/g，故確定液料比30 ∶ 1為最優(yōu)提取條件。

2.3.3 提取時(shí)間 精密稱取6份蓽茇細(xì)粉（過(guò)80目標(biāo)準(zhǔn)篩），每份1.00 g，分別置于圓底燒瓶中，加入30倍量的無(wú)水乙醇，浸潤(rùn)30 min后，分別加熱回流提取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，計(jì)算不同提取時(shí)間下樣品總生物堿的提取率。結(jié)果顯示，加熱回流0.5、1、2、3、4、5 h后蓽茇總生物堿的提取率分別為3.05、3.26、3.59、3.75、3.66、3.58 mg/g，故確定加熱回流提取3 h為最優(yōu)提取時(shí)間。

2.3.4 提取次數(shù) 精密稱取4份的蓽茇細(xì)粉（過(guò)80目標(biāo)準(zhǔn)篩），每份1.00 g，分別置于圓底燒瓶中，加入30倍量的無(wú)水乙醇，浸潤(rùn)30 min后，分別回流提取1、2、3、4次，每次提取時(shí)間為3 h，計(jì)算出不同提取次數(shù)下樣品總生物堿的提取率。結(jié)果顯示，提取1、2、3、4次后蓽茇總生物堿的提取率分別為3.75、4.16、4.93、4.96 mg/g，故確定最優(yōu)提取次數(shù)為3次。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.4.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇粉碎度（X1）、液料比（X2）、提取時(shí)間（X3）、提取次數(shù)（X4）作為考察因素，采用四因素三水平的響應(yīng)曲面法進(jìn)行試驗(yàn)。因素與水平見(jiàn)表1，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.2 模型建立與方差分析 通過(guò)Design Expert 8.06軟件對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程：總生物堿提取率（Y）=5.01+0.22X1-0.26X2-0.28X3-0.15X4-0.18X12-0.43X22-0.31X32-0.23X42+0.29X1X2+0.17X1X3-0.15X1X4+0.17X2X3+0.19X2X4+0.27X3X4（R2=0.991 3）。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，蓽茇總生物堿提取模型的P<0.05，表明該回歸模型是顯著的，用該模型對(duì)蓽茇總生物堿的提取工藝進(jìn)行分析試驗(yàn)是合理的。根據(jù)表3中F值的大小，推測(cè)影響本試驗(yàn)提取率大小的因素為X1>X2>X3>X4。從表3中還可以看出，二次項(xiàng)X22、X32、X42對(duì)響應(yīng)值的影響顯著（P<0.05）。

2.4.3 響應(yīng)面分析 用Design Expert 8.06軟件分析，得出影響蓽茇總生物堿提取率的各因素交互作用的響應(yīng)面圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，隨著液料比的增大，蓽茇總生物堿的提取率先呈緩慢上升趨勢(shì)，達(dá)到最大值后開(kāi)始下降；隨著提取時(shí)間的增加，能增大蓽茇總生物堿的提取率，但是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)其提取率有所下降；隨著提取次數(shù)的增加，提取率有先上升后下降的趨勢(shì)；從圖中也可知，粉碎度的改變對(duì)提取率的影響較大，隨著粉碎度的增加，提取率逐漸增大，當(dāng)達(dá)到一定程度時(shí)，提取率上升緩慢；同時(shí)，隨著液料比的增大，蓽茇總生物堿的提取率也呈現(xiàn)先緩慢上升然后降低的趨勢(shì)，兩者交互影響較顯著。

根據(jù)上述所得結(jié)果，由Design Expert 8.06軟件分析得出：在穩(wěn)定狀態(tài)下蓽茇提取量的最大值為5.021 mg/g，相對(duì)應(yīng)的粉碎度90.26目、液料比32.16 ∶ 1、提取時(shí)間2.86 h，提取次數(shù)2.91次。以實(shí)際操作的方便考慮，將其修正為粉碎度90目，液料比32 ∶ 1，提取時(shí)間170 min，提取次數(shù)3次。

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)優(yōu)化提取工藝，分別取蓽茇樣品1.00、10.00和100.00 g進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果蓽茇總生物堿的平均提取率分別為5.015、5.028和5.041 mg/g（RSD分別為1.5%、2.2%、2.7%，n=3），與預(yù)測(cè)值5.025 mg/g的相對(duì)誤差分別為0.20%、0.06%、0.26%。3次平行試驗(yàn)的提取率差異較小，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可靠。

3 討論

中藥蓽茇的化學(xué)成分中含有大量的生物堿，而胡椒堿作為其中主要存在的生物堿[14]，含量高、結(jié)構(gòu)明確、性質(zhì)穩(wěn)定、有明顯的紫外吸收，故本研究以胡椒堿作為指標(biāo)性成分考察蓽茇總生物堿的提取工藝，具有可行性和科學(xué)性。

為了優(yōu)化蓽茇總生物堿的提取工藝，筆者通過(guò)預(yù)試驗(yàn)先后考察了提取溶劑的種類、藥材粉碎度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度、溶劑的濃度、液料比等對(duì)總生物堿提取率的影響。在溶劑方面，筆者首先分別選擇了無(wú)水乙醇、無(wú)水乙酸乙酯和水為溶劑，結(jié)果以無(wú)水乙醇為溶劑提取效果最好；接著，筆者又分別考察了無(wú)水乙醇、90%乙醇和80%乙醇的提取效果，結(jié)果隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的降低，蓽茇總生物堿提取率明顯減小，故在本研究中選用無(wú)水乙醇為提取溶劑。在提取溫度方面，預(yù)試驗(yàn)中筆者分別設(shè)置提取溫度為50、60、70、80 ℃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度為50、60 ℃時(shí)，總生物堿的提取率很低，而將溫度從70 ℃升高至80 ℃時(shí)，總生物堿的提取率變化不大，故在本研究中未將提取溫度作為考察因素。而同時(shí)進(jìn)行的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，藥材粉碎度、提取時(shí)間、液料比、提取次數(shù)的改變對(duì)蓽茇總生物堿提取率的影響較大。因此，在本研究中筆者選取上述4個(gè)因素對(duì)蓽茇總生物堿的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

本研究結(jié)果顯示，將蓽撥粉碎太細(xì)時(shí)總生物堿的提取率會(huì)下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)細(xì)的粉末使得其吸附作用增強(qiáng)，導(dǎo)致擴(kuò)散速度而降低，最后影響其浸出效果；也可能是因?yàn)榉鬯樘?xì)使得藥材的細(xì)胞破裂，致使大量不溶物增加。而較粗的粉末也會(huì)導(dǎo)致提取率較低，這可能是與溶劑的接觸面小，影響擴(kuò)散速度和浸出效果有關(guān)。蓽茇的化學(xué)成分中包含的胡椒堿、蓽茇明寧堿等生物堿的化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，故較長(zhǎng)的提取時(shí)間能獲得較高的提取率。合適的料液比能有效除去中藥蓽茇中的脂質(zhì)、鞣質(zhì)等雜質(zhì)，有助于提高總生物堿的提取率。隨著提取次數(shù)的增加，在一定次數(shù)范圍內(nèi)能提高其提取率，但是隨著提取次數(shù)的繼續(xù)增加，溶液中殘留的生物堿含量降低，由于提取時(shí)間的延長(zhǎng)，可能破壞酰胺類生物堿等化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致提取率降低。

綜上所述，筆者采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化了蓽茇中總生物堿提取工藝，且優(yōu)化后的提取工藝合理可行。

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（收稿日期：2018-01-19 修回日期：2018-04-10）

（編輯：林 靜）