大鼠免疫抑制長(zhǎng)期模型的建立及驗(yàn)證

馬盼盼 葉軍 楊艷芳 張星 王洪亮 劉玉玲

摘 要 目的：建立可用于免疫調(diào)節(jié)劑長(zhǎng)期（1個(gè)月）藥效評(píng)價(jià)的大鼠免疫抑制長(zhǎng)期模型并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。方法：以Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以環(huán)磷酰胺（CTX）為誘導(dǎo)劑。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和治療組，每組5只。模型組大鼠以35 mg/kg的CTX連續(xù)腹腔注射3 d，之后以相同劑量每周腹腔注射1次進(jìn)行加強(qiáng)誘導(dǎo)，共加強(qiáng)誘導(dǎo)3次，全程31 d；正常對(duì)照組大鼠不作任何處理；治療組大鼠在模型組大鼠建模的基礎(chǔ)上，于第3天建模后肌內(nèi)注射胸腺五肽（TP5）注射液1 mg/kg，隔天注射1次至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。觀察整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)大鼠的精神狀況和體質(zhì)量變化，分別于第4、11、18、25、32天取血，測(cè)定外周血中CD4+/CD8+比值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，測(cè)定其胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠精神狀態(tài)較差，體質(zhì)量增加較緩慢，各時(shí)間點(diǎn)的CD4+/CD8+比值和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的胸腺指數(shù)均明顯降低，脾指數(shù)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，治療組大鼠精神狀態(tài)和體質(zhì)量增加速度均有所改善，第11、25、32天的CD4+/CD8+比值和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的胸腺指數(shù)均明顯升高，脾指數(shù)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：成功建立大鼠免疫抑制長(zhǎng)期模型，該模型免疫抑制程度適中，可用于免疫調(diào)節(jié)劑1個(gè)月內(nèi)的藥效評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞 免疫抑制；長(zhǎng)期模型；環(huán)磷酰胺；胸腺五肽；免疫調(diào)節(jié)劑；藥效學(xué)；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a long-term immunosuppressive rat model for immunomodulator long-term pharmacodynamic evaluation （1 month）. METHODS： Wistar rats were selected as experimental animal and cyclophosphamide （CTX） was selected as an inducer. Rats were randomly divided into normal control group， model group and treatment group， with 5 rats in each group. Model group was given 35 mg/kg CTX intraperitoneally for consecutive 3 d， and then given same dose once a week to induce model， 3 times in total， for 31 d. Normal control group was not given any treatment. Treatment group was additionally given Thymopentin （TP5） injection 1 mg/kg at third day after modeling， every other day， till the end of experiment， on the basis of model group. The changes of mental status and body weight were observed during the whole experimental period. Blood samples were collected at 4th， 11th， 18th， 25th， 32th day， and CD4+/CD8+ ratio of peripheral blood was determined. Rats were sacrificed after experiment， and thymus index and spleen index were measured. RESULTS： Compared with normal control group， mental state of the rats in the model group was poor and the body weight increased slowly； CD4+/CD8+ ratio at different time points and thymus index after experiment were decreased significantly in model group， while spleen index increased significantly， with statistical significance （P<0.05）. Compared with model group， mental state of the rats and the increase of body weight were all improved in treatment group. CD4+/CD8+ ratio at 11th， 25th， 32th day and thymus index after experiment were increased significantly， while spleen index was decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）. CONCLUSIONS： The long-term immunosuppressive rat model is established successfully. The immunosuppressive level of the model is middle， and it can be used for pharmacodynamic evaluation of immunomodulator within 1 month.

KEYWORDS Immunosuppression； Long-term model； Cyclophosphamide； Thymopentin； Immunomodulator； Pharmacodynamics； Rats

蛋白多肽類(lèi)免疫調(diào)節(jié)劑可用于多種疾病的治療，但治療周期長(zhǎng)，需長(zhǎng)期頻繁注射。為此，針對(duì)蛋白多肽類(lèi)藥物的長(zhǎng)效制劑的研究備受關(guān)注。針對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑長(zhǎng)效制劑的藥效學(xué)評(píng)價(jià)，目前還沒(méi)有合適的動(dòng)物模型。

常規(guī)免疫抑制模型的建立，常用方法是給予大鼠或小鼠特定劑量的誘導(dǎo)劑環(huán)磷酰胺（CTX）[1-3]連續(xù)腹腔注射3 d誘導(dǎo)動(dòng)物免疫功能低下，但動(dòng)物通常在造模后2周內(nèi)即可自行從免疫功能低下恢復(fù)至正常水平，因此，常規(guī)模型很難滿(mǎn)足免疫調(diào)節(jié)劑長(zhǎng)期給藥或長(zhǎng)效制劑的藥效學(xué)評(píng)價(jià)需求。通過(guò)加大CTX的誘導(dǎo)劑量或增加給藥頻率，動(dòng)物免疫抑制的時(shí)間將有所延長(zhǎng)，但在已有研究中，一般僅在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物的免疫水平進(jìn)行考察，未對(duì)造模過(guò)程中動(dòng)物的免疫抑制狀態(tài)的變化情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

本文選擇較大劑量的誘導(dǎo)劑CTX誘導(dǎo)并適時(shí)強(qiáng)化的造模策略，建立大鼠免疫抑制長(zhǎng)期（擬定1個(gè)月）模型。并將模型組與正常對(duì)照組及胸腺五肽（TP5）注射液長(zhǎng)期多次給藥治療組比較，以大鼠生長(zhǎng)情況、免疫學(xué)指標(biāo)CD4+/CD8+比值、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)為指標(biāo)監(jiān)測(cè)造模周期內(nèi)大鼠的免疫水平變化情況，進(jìn)而評(píng)價(jià)免疫抑制長(zhǎng)期模型的可行性。

1 材料

1.1 儀器

FACS Verse型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences公司）；1-14型離心機(jī)（德國(guó)Sigma-Aldrich公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用CTX（美國(guó)Baxter公司，批號(hào)：6D108A，規(guī)格：0.2 g/支）；TP5注射液（海南中和藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20161006，規(guī)格：1 mL ∶ 10 mg）；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鼠源CD3抗體（FITC anti-rat CD3）、藻紅蛋白標(biāo)記的鼠源CD4抗體（PE anti-rat CD4）和別藻青蛋白標(biāo)記的鼠源CD8抗體（Alexa Fluor 647 anti-rat CD8a）（美國(guó)Biolegend公司，批號(hào)分別為：B233749、B201139、B214521）；紅細(xì)胞裂解液（美國(guó)BD Biosciences公司，批號(hào)：5356501，10倍稀釋后使用）；磷酸鹽緩沖液（PBS，美國(guó)HyClone公司，批號(hào)：ABC211556）；牛血清白蛋白（BSA，碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ST023，純度：>98%）；肝素鈉（北京百靈威科技有限公司，批號(hào)：20070131，純度：170 u/mg）。

1.3 動(dòng)物

Wistar 大鼠，SPF級(jí)，♂，體質(zhì)量170～190 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK（京） 2016-0011，動(dòng)物合格證號(hào)：No.11400700- 209934。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與動(dòng)物福利委員會(huì)同意。

2 方法

2.1 分組

大鼠于動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和治療組，每組5只。

2.2 建模

以35 mg/kg的劑量連續(xù)腹腔注射CTX 3 d，之后每周以相同劑量腹腔注射1次加強(qiáng)誘導(dǎo)，共加強(qiáng)誘導(dǎo)3次，建立免疫抑制長(zhǎng)期模型。通過(guò)對(duì)比正常對(duì)照組和模型組的免疫水平，判斷免疫抑制長(zhǎng)期模型是否建立成功。此外，在建?；A(chǔ)上設(shè)立治療組，于整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)多次給予TP5注射液，以期進(jìn)一步考察免疫抑制長(zhǎng)期模型大鼠經(jīng)治療后機(jī)體免疫水平的恢復(fù)情況，進(jìn)而驗(yàn)證該模型是否可用于評(píng)價(jià)免疫調(diào)節(jié)劑的藥效。

2.3 給藥方案

正常對(duì)照組大鼠不作任何處理。模型組大鼠以建模第1天計(jì)，分別于第1、2、3、11、18、25天腹腔注射CTX，給藥劑量為35 mg/kg。治療組大鼠在模型組大鼠建?；A(chǔ)上，于建模第3天后開(kāi)始肌內(nèi)注射TP5注射液，給藥劑量為1 mg/kg[4]，隔天注射1次至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共給藥14次，實(shí)驗(yàn)周期全程32 d。

2.4 取血方案

以建模第1天計(jì)，分別于第4、11、18、25、32天（其中治療組第4天為先取血后給予TP5注射液）采集大鼠眼底靜脈叢外周血約0.3 mL，置于預(yù)先涂有肝素鈉的離心管中，備用。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)

2.5.1 生長(zhǎng)情況 以建模第1天開(kāi)始計(jì)，于第1、4天稱(chēng)量各組大鼠體質(zhì)量，之后分別于加強(qiáng)誘導(dǎo)前1 d稱(chēng)量各組大鼠體質(zhì)量，繪制整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)大鼠的體質(zhì)量變化曲線(xiàn)，并觀察整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)大鼠的精神狀態(tài)。

2.5.2 免疫器官指數(shù) 于第32天取血后麻醉處死各組大鼠，取其胸腺和脾，將胸腺和脾組織周?chē)闹咎蕹?，稱(chēng)質(zhì)量。按公式計(jì)算免疫器官指數(shù)：免疫器官指數(shù) （mg/g）=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

2.5.3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+比值 取100 μL抗凝血于2 mL離心管中，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻，于室溫孵育裂解10 min，期間不時(shí)輕輕振搖，待完全溶血后向離心管中加入0.5 mL含1% BSA的PBS，封閉，以300×g離心5 min，棄上清液，留下管底沉淀的細(xì)胞。按照上述步驟再重復(fù)裂解一次至紅細(xì)胞裂解完全，加入1.5 mL PBS，與細(xì)胞混勻，300×g離心5 min，棄上清液，洗滌3次，以去除細(xì)胞碎片。再分別以200 ∶ 1、80 ∶ 1、50 ∶ 1的比例于PBS中加入FITC anti-rat CD3、PE anti-rat CD4、Alexa Fluor 647 anti-rat CD8a抗體，混勻，取50 μL混合抗體溶液于離心管中，混勻，室溫避光孵育30 min作為樣品管。另設(shè)空白管和單染管?？瞻坠懿蛔魈幚?，用于調(diào)節(jié)儀器電壓，單染管中分別加入FITC anti-rat CD3、PE anti-rat CD4、Alexa Fluor 647 anti-rat CD8a單一抗體，用于調(diào)節(jié)儀器補(bǔ)償，其他操作與樣品管一致。每支離心管中加入1.5 mL PBS混勻，以300×g離心5 min，棄上清液，洗滌3次，以去除游離的抗體。最后加入0.5 mL PBS，混勻，制成單細(xì)胞懸液樣品，將樣品過(guò)300目篩后上流式細(xì)胞儀測(cè)定CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算CD4+/CD8+比值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2010軟件處理。數(shù)據(jù)以x±s表示，3組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 生長(zhǎng)情況

3.1.1 體質(zhì)量 各組大鼠實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)的體質(zhì)量變化曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)模型組大鼠體質(zhì)量均比正常對(duì)照組大鼠低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。與模型組比較，治療組大鼠的體質(zhì)量稍高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3.1.2 精神狀態(tài) 連續(xù)建模3 d后，模型組大鼠明顯不如正常對(duì)照組大鼠活躍，且模型組大鼠精神不振，被抓取時(shí)掙脫不如正常對(duì)照組大鼠明顯，掙脫力氣明顯減小。治療組大鼠給予TP5注射液治療1周后至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，精神狀態(tài)稍好于模型組，被抓取時(shí)能夠明顯感覺(jué)到治療組大鼠的掙脫力氣比模型組大，但是整體狀態(tài)不如正常對(duì)照組大鼠活躍。

3.2 免疫器官

各組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

胸腺是重要的中樞免疫器官，隨著免疫功能的降低或者年齡的增長(zhǎng)，胸腺會(huì)逐漸萎縮，其質(zhì)量可反映免疫功能的高低[5-6]。由表1可以看出，模型組大鼠胸腺指數(shù)明顯低于正常對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這說(shuō)明該建模條件下模型組大鼠免疫功能受到抑制。治療組大鼠胸腺指數(shù)明顯高于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這說(shuō)明該模型大鼠的免疫功能經(jīng)治療后有所恢復(fù)，進(jìn)一步說(shuō)明了所建立的長(zhǎng)期模型免疫抑制程度適中。

脾是機(jī)體最大的外周免疫器官[5-6]，受到免疫抑制影響時(shí)，淋巴組織萎縮，致脾體積縮小。由表1可以看出，模型組大鼠脾指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療組大鼠脾指數(shù)明顯低于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。該結(jié)果與理論不符，產(chǎn)生以上結(jié)果的原因可能是，大鼠脾受到免疫抑制的作用在2周后會(huì)逐漸消失，繼而出現(xiàn)脾指數(shù)代償性增高和脾腫大現(xiàn)象[6]。

3.3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+/CD8+比值

各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的CD4+/CD8+比值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可以看出，與正常對(duì)照組比較，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)模型組大鼠的CD4+/CD8+比值均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），這說(shuō)明該建模方案可使大鼠在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)維持穩(wěn)定的免疫抑制狀態(tài)，免疫抑制長(zhǎng)期模型建立成功。治療組大鼠在給予TP5注射液治療后CD4+/CD8+比值明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示該模型對(duì)大鼠的免疫抑制程度適中，使用免疫調(diào)節(jié)劑可使大鼠免疫抑制狀態(tài)有所恢復(fù)。

從以上指標(biāo)可以看出，大鼠連續(xù)腹腔注射CTX 3 d后，其免疫功能明顯下降，通過(guò)之后的加強(qiáng)誘導(dǎo)，2周后的大鼠仍處于免疫功能低下的狀態(tài)，對(duì)其給予免疫調(diào)節(jié)劑TP5注射液進(jìn)行治療后，大鼠的免疫功能有所恢復(fù)。

4 討論

T淋巴細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要成分，T淋巴細(xì)胞有2個(gè)主要亞群，即CD4+ T淋巴細(xì)胞和CD8+ T淋巴細(xì)胞。在正常情況下， CD4+ T淋巴細(xì)胞和CD8+ T淋巴細(xì)胞在體內(nèi)維持著穩(wěn)定的比例，處于平衡狀態(tài)，共同參與機(jī)體的免疫應(yīng)答。CD4+/CD8+比值是重要的免疫狀態(tài)檢測(cè)指標(biāo)，可反映機(jī)體免疫水平的高低，比值降低說(shuō)明細(xì)胞免疫功能下降[8-10]。采用流式細(xì)胞儀先測(cè)定CD3+ T淋巴細(xì)胞，CD3+ T淋巴細(xì)胞代表總的T淋巴細(xì)胞，再測(cè)定CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)量（先測(cè)定CD3+ T淋巴細(xì)胞可避免直接測(cè)定的CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞中包含有假陽(yáng)性的CD3+ T淋巴細(xì)胞，從而使CD4+/CD8+比值更準(zhǔn)確），計(jì)算CD4+/CD8+比值，評(píng)價(jià)機(jī)體的免疫功能。

TP5是一種療效確切、安全性好的雙向免疫調(diào)節(jié)劑[11-12]，臨床使用的制劑形式有TP5注射液和TP5注射用凍干粉，療程3～24個(gè)月不等[13]。郝華珍等[4]以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為材料制備的TP5/PLGA長(zhǎng)效微球取得了良好進(jìn)展，大鼠藥動(dòng)學(xué)考察結(jié)果表明，TP5/PLGA長(zhǎng)效微球的釋藥周期可達(dá)1～2個(gè)月，但現(xiàn)有常規(guī)免疫抑制模型不能滿(mǎn)足其免疫藥效學(xué)的評(píng)價(jià)需求。

關(guān)于常規(guī)免疫抑制模型，有研究[14-15]報(bào)道采用大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以35 mg/kg劑量連續(xù)腹腔注射CTX 3 d誘導(dǎo)建立免疫抑制模型，在建模3 d結(jié)束后開(kāi)始單次或多次給予TP5制劑，給藥7 d后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，以CD4+/CD8+比值、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)等指標(biāo)的變化，考察了TP5的免疫調(diào)節(jié)作用。

通過(guò)加大CTX的誘導(dǎo)劑量或給藥頻率，動(dòng)物免疫抑制的時(shí)間將有所延長(zhǎng)，但如果劑量或給藥頻率掌握不合理，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡。楊穎等[16]對(duì)小鼠免疫抑制的長(zhǎng)期模型進(jìn)行了研究，以外周血T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞為指標(biāo)，探討了小劑量每天建模（每天腹腔注射CTX 40 mg/kg，連續(xù)30 d）和較大劑量建模適時(shí)強(qiáng)化（每天腹腔注射CTX 80 mg/kg，連續(xù)3 d，之后每周強(qiáng)化1次）對(duì)小鼠免疫功能的影響，于30 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)相應(yīng)的指標(biāo)。結(jié)果表明，造模30 d時(shí)小鼠仍可處于免疫功能低下?tīng)顟B(tài)。但該文獻(xiàn)僅對(duì)建模結(jié)束后的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了研究，未對(duì)建模過(guò)程中小鼠的免疫抑制狀態(tài)的變化情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

本文針對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑長(zhǎng)效微球的藥效學(xué)評(píng)價(jià)需求，在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，確定合理的CTX誘導(dǎo)劑量范圍，選擇較大劑量CTX誘導(dǎo)并適時(shí)強(qiáng)化的建模策略，建立大鼠免疫抑制長(zhǎng)期（1個(gè)月）模型。CTX給藥劑量的選擇參考文獻(xiàn)[14-15]中建立常規(guī)免疫抑制模型時(shí)的給藥劑量即每日35 mg/kg，并適時(shí)加強(qiáng)誘導(dǎo)。

本研究結(jié)果表明，以35 mg/kg的給藥劑量連續(xù)腹腔注射CTX 3 d，之后每周以35 mg/kg的給藥劑量腹腔注射1次加強(qiáng)誘導(dǎo)，共加強(qiáng)誘導(dǎo)3次，可建立免疫抑制長(zhǎng)期（1個(gè)月）模型。本文所建立的免疫抑制長(zhǎng)期模型可為免疫調(diào)節(jié)劑的長(zhǎng)期給藥或免疫長(zhǎng)效制劑的免疫功能評(píng)價(jià)提供具有參考價(jià)值的藥效學(xué)模型。

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（收稿日期：2018-03-02 修回日期：2018-05-14）

（編輯：鄒麗娟）